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R5421 Chemically Competent Cell

产品规格 （CAT#: YC1080）

R5421 Competent Cell:                                       100μl/支               保存： -80℃（3个月）

pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl               保存：-80℃（12个月）

Carrier DNA (10 μg/μl)                                             100μl              保存：-20℃（12个月）

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存：    4℃（12个月）

基因型

MATα ura3-52 leu2 trk1Δ his3Δ200 his4-15 trk2Δ1::pCK64

R5421 Chemically Competent Cell产品说明

R5421酿酒酵母菌株为K⁺/钾离子缺陷型菌株，在文献中也称为CY162，MATα型，多用于K⁺/钾离子转运蛋白的鉴定试验中，也可用于K⁺/钾离子通道或钠钾离子泵的鉴定试验。Transformation marker为：ura3，leu2，该菌株可以在含有100mM KCl的培养基中国正常生长，在含有5-10mM KCl的培养基中生长缓慢，当培养基中KCl浓度低于0.5mM，R5421（CY162）细胞停止生长。R5421感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒检测转化效率>10³ cfu/μg DNA。

操作方法

1. Carrier DNA 在每次使用前要通过加热处理使其变性为单链状态，步骤如下：Carrier DNA 放95℃水浴或金属浴3 min，快速插入冰中，静置3 min，再次放95℃水浴或金属浴3 min，快速插入冰中，静置3 min以上。

2. 取100 µl冰上融化的R5421感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒0.5-3 µg，Carrier DNA10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。

3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。

4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH₂O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。

5. ddH₂O 50 µl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。

注意事项

1. 感受态细胞在冰上融化。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少终用于涂板的菌量。

3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

4. R5421酵母菌株对高温敏感，适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。

5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。