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EGY48  Chemically Competent Cell

产品规格 

EGY48 Competent Cell:                                       100μl/支              保存： -80℃（3个月）

pGBKT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl              保存：-80℃（12个月）

Carrier DNA (10 μg/μl)                                             100μl              保存：-20℃（12个月）

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存：    4℃（12个月）

基因型

MATα, ura3, his3, trp1, LexAop (x6)-LEU2

产品说明

EGY48菌株是Clontech公司开发的LexA系统酵母双杂实验用菌株，MATα型，可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验；Transformation marker为：his3，trp1，ura3，报告基因为：LEU2；报告基因UAS (上游激活序列)来源于LexA op(x6)，只有当 Bait和 Prey互作时才能启动 LEU2表达。EGY48-LexA酵母双杂系统系统需要三种质粒配套使用：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ。质粒pLexA的筛选标志为HIS3，用于表达DNA-BD(来自原核的202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白 (Bait)的融合蛋白；质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，用于表达AD(来自疱疹病毒的88个氨基酸残基组成的B42AD蛋白)与目标蛋白 (Prey)的融合蛋白；报告质粒p8op-LacZ的筛选标志为URA3，报告基因为LacZ，报告基因UAS来源于LexA op(x6)，只有当 Bait和 Prey互作时才能启动 LacZ表达。EGY48感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGBKT7质粒检测转化效率>10⁴ cfu/μg DNA。

操作方法
1. 取100 μl冰上融化的EGY48感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5ug，Carrier DNA（95-100度5min,快速冰浴，重复一次）10 ul ，PEG/LiAc  500ul并吸打几次混匀，30度水浴30 分钟（15 min时翻转6-8次混匀）。
2. 将管放42度水浴15min  （7.5 min时翻转6-8次混匀）。   
3. 5000 rpm 离心 40s 弃上清，ddH2O 400ul 重悬，离心 30s 弃上清。                       

4. ddH2O 50ul重悬，涂板,29℃培养48-96h。

注意事项

1. 感受态细胞在冰上融化。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少终用于涂板的菌量。

3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

4. EGY48酵母菌株对高温敏感，适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。

5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90 h培养可见直径1 mm克隆。