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Y187 Chemically Competent Cell

产品规格

Y187 Competent Cell:                                         100μl/支              保存： -80℃（3个月）

pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl              保存：-80℃（12个月）

Carrier DNA (10 μg/μl)                                            100μl              保存：-20℃（12个月）

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存：    4℃（12个月）

基因型

MATα, ura3-52, his3-200, ade 2-101, trp 1-901, leu 2-3, 112, gal4Δ, met-, gal80Δ, URA3::GAL1_UAS-GAL1_TATA-lacZ, MEL1

Y187 Chemically Competent Cell产品说明

Y187菌株是Clontech公司开发的GAL4系统酵母单杂，双杂实验用菌株，MATα型，可直接转化质粒或与MATa型酵母菌株 (Y2HGold，AH109等)通过mating操作进行筛库试验。Transformation marker为: trp1, leu2，报告基因为：lacZ，MEL1。Y187-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：pGBKT7和pGADT7。质粒pGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD (来自酵母转录因子GAL4N端1~174位氨基酸)与目标蛋白 (Bait)的融合蛋白；质粒pGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD (GAL4 C端768~881位氨基酸)与目标蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N端1~174位氨基酸区段的DNA结合域 (DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸区段的转录激活域 (AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成 bait融合蛋白 (bait –BD)和 prey融合蛋白 (prey-AD)，如果 bait和 prey发生相互作用，就会促使 BD和 AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。Y187有两个报告基因：lacZ，MEL1，分别由两种不同的启动子 (G1，M1)启动，这两种启动子只有GAL4识别的17 bp核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。Y187感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒检测转化效率>10⁴ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 取100 µl冰上融化的Y187感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，Carrier DNA (95-100度5 min，快速冰浴，重复一次）10 µl，PEG/LiAc 500µl并吸打几次混匀，30度水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。

2. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。

3. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH₂O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。

4. ddH₂O 50 µl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。

注意事项

1. 感受态细胞在冰上融化。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少终用于涂板的菌量。

3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

4. Y187酵母菌株对高温敏感，适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。

5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90 h培养可见直径1 mm克隆。