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Y1HGold Chemically Competent Cell

产品规格 

Y1HGold Competent Cell:                                  100μl/支              保存： -80℃（3个月）

pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl              保存：-80℃（12个月）

Carrier DNA (10 μg/μl)                                            100μl              保存：-20℃（12个月）

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存：    4℃（12个月）

基因型

MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, met-, MEL1

Y1HGold Chemically Competent Cell产品说明

Y1HGold菌株是Clontech公司开发的GAL4-AbA酵母单杂系统用菌株，MATα型，可直接转化质粒进行筛库试验。Transformation marker为：ura3，leu2；报告基因为：AbAr。Y1HGold-GAL4-AbA 酵母单杂系统需要两种质粒配套使用：pAbAi 和PGADT7。质粒pAbAi的筛选标志为URA，用于表达 pBait-AbAi construct (1~3个bait DNA序列重复串联后克隆到pAbAi中)；质粒pGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)与目标蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4-AbA酵母单杂系统原理：Aureobasidin A (AbA)是一种环酯肽抗生素，在低浓度 (0.1-0.2 µg/ml)下即可对酵母产生毒性。基因组中整合了pBait-AbAi 的酵母菌株 (Bait-Reporter Yeast Strains)，当猎物蛋白 (Prey)结合到诱饵序列 (Bait DNA)上，GAL4 AD就会激活AbAr的表达，从而能够在含有抗生素AbA 的培养基上生长。AbAr与营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，可以降低酵母单杂假阳性发生的概率。Y1HGold感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒检测转化效率>10⁴ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 取pBait-AbAi质粒5µg，BstBI或 BbsI酶切1小时，回收。

2. 取100 μl冰上融化的Y1HGold感受态细胞，依次加入预冷的线性pBait-AbAi质粒1-5 µg（体积不高于15 µl），Carrier DNA (95-100度5 min,快速冰浴，重复一次) 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30度水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。

3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。

4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH₂O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。

4. ddH₂O 50 µl重悬，涂SD/-Ura平板，29℃培养72 h。

5. 挑取5-10个克隆，用PCR方法确定pBait-AbAi 整合到Y1HGold 基因组中，PCR 阳性菌株在SD/-Ura平板划线，29℃培养72 h，4℃保存，此菌株即是Y1HGold[Bait/AbAi] 菌株。

注意事项

1. 感受态细胞在冰上融化。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少终用于涂板的菌量。

3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

4. Y1HGold酵母菌株对高温敏感，适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。

5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90 h培养可见直径1 mm克隆。