α-淀粉酶 ( α-AL) 活性检测试剂盒说明书

α-淀粉酶 ( α-AL) 活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

规格：100T/48S

产品内容：

试剂一：液体 20mL×1 瓶，室温保存。若有黄色晶体析出，可适当加热溶解后再用。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 10mL 蒸馏水，置于常温水中并加热至煮沸，期间 不断搅拌粉剂至溶解。

标准品：粉剂×1 支，10mg 无水葡萄糖，临用前加 1mL 蒸馏水，配成 10mg/mL 葡萄糖标准液。

产品说明：

淀粉水解酶，包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-AL (EC 3.2. 1. 1)随机催化淀粉中α- 1,4-糖苷键水解，生 成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。

淀粉水解酶催化淀粉水解生成还原糖，还原糖还原 3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质，在 540 nm 有吸收峰；通过测定 540 nm 吸光度增加速率，计算淀粉酶活性。α-AL 耐热，但是β-淀粉酶可在 70℃ 钝化 15min 。因此粗酶液经过 70℃钝化 15min ，就只有α-AL 能够催化淀粉水解。

需自备的仪器和用品：

酶标仪或可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、96  孔板/微量比色皿、 研钵和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

称取约 0. 1g 样本，加 0.8 mL 蒸馏水匀浆；匀浆后在室温下放置提取 15min ，每隔 5min 振荡 1

次，使其充分提取；6000g ，室温离心 10min ，吸取上清液并且加蒸馏水定容至 10 mL ，摇匀，即为 淀粉酶原液。

二、测定步骤和加样表 (在 EP 管中依次加入下列试剂)：

1 、分光光度计预热 30min 以上，调节波长到 540 nm ，蒸馏水调零。

2 、将葡萄糖标准液用蒸馏水稀释为 1 、0.5 、0.25 、0. 125 、0.0625 、0.03125 、0.015625 、0.0078 和 0.0039mg/mL 的标准溶液。

3 、按操作表依次加入各试剂：

试剂 (μL)对照管测定管标准管空白管

α- 淀粉酶原液7575--

蒸馏水---75

标准溶液 (mg/mL)--75-

70℃水浴 15min 左右，冷却

试剂一150---

将以上对照管、测定管和试剂二置于 40℃恒温水浴中保温 10min 左右

试剂二75757575

在 40℃恒温水浴中准确保温 5min

试剂一-150150150

混匀，90℃ 水浴 10min ，取 200μL 至 96 孔板或微量比色皿中，540nm 处读取对照管、测定管、 标准管、空白管的吸光度，分别记为 A 对照、A 测定、A 标准和 A 空白，计算ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

三、α-淀粉酶活性计算：

1 、标准曲线的绘制

以ΔA 标准为 y 轴，以标准溶液浓度为 x 轴，绘制标准曲线，得到方程 y=kx+b 。将ΔA 测定带 入方程得到 x  (mg/mL)。

2 、α- 淀粉酶活性的计算

a.        按照样本鲜重计算

单位定义：每g 组织每分钟催化产生1mg  还原糖定义为1个酶活力单位。

α-  淀粉酶活性(mg/min/g  鲜重)=x×V  样÷(W×V  样÷V  样总)÷T=2×x÷W

b.       按照蛋白质浓度计算

单位定义：每mg  组织蛋白每分钟催化产生1mg 还原糖定义为1个酶活性单位。 α-淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= x×V 样÷  (V 样×Cpr) ÷T=0.2×x÷Cpr

V  样：加入反应体系中样本体积，0.075 mL；V  样总：提取液总体积，10 mL；  Cpr：样本蛋

白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；T ：反应时间，5min。

注意事项：

当测定的吸光值大于 1.5 时，可以对样本进行适当稀释后测定。

本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！

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