乙酰乳酸合成酶（ALS）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC5525

规格：50T/24S、100T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

50T溶液的配制：

1、 试剂一：临用前将试剂一A，试剂一B溶于试剂一C中，充分溶解。未用完的试剂分装保存，-20℃保存可以保存4周，避免反复冻融。

2、 试剂三：临用前将试剂三A，试剂三B溶于试剂三C中，充分溶解。未用完的试剂分装保存，-20℃保存可以保存4周，避免反复冻融。

3、 试剂六：临用前加入1mL无水乙醇溶解。-20℃可保存4周。

4、 试剂六工作液：临用前根据样本量按试剂六：试剂六稀释液=0.1mL：0.7mL（共0.8mL，8T）的比例配制，现用现配。当天用完。

5、 标准品：100μmol/mL 乙偶姻标准液（即10⁵ nmol/mL 乙偶姻标准液）。

6、 100nmol/mL标准溶液的配制：取10⁵ nmol/mL 乙偶姻标准液50μL和950μL蒸馏水混合，即5000nmol/mL标准溶液；再取20μL 5000nmol/mL标准溶液和980μL蒸馏水混合，即100nmol/mL标准溶液。

100T溶液的配制：

1、 试剂一：临用前将试剂一A，试剂一B加入试剂一C中，充分溶解。未用完的试剂分装保存，-20℃保存可以保存4周，避免反复冻融。

2、 试剂三：临用前将试剂三A，试剂三B溶于试剂三C中，充分溶解。未用完的试剂分装保存，-20℃保存可以保存4周，避免反复冻融。

3、 试剂六：临用前加入2mL无水乙醇溶解。-20℃可保存4周。

4、 试剂六工作液：临用前根据样本量按试剂六：试剂六稀释液=0.1mL：0.7mL（共0.8mL，8T）的比例配制，现用现配。当天用完。

5、 标准品：100μmol/mL 乙偶姻标准液（即10⁵ nmol/mL 乙偶姻标准液）。

6、 100nmol/mL标准溶液的配制：取10⁵ nmol/mL 乙偶姻标准液50μL和950μL蒸馏水混合，即5000nmol/mL标准溶液；再取20μL 5000nmol/mL标准溶液和980μL蒸馏水混合，即100nmol/mL标准溶液。

产品说明：

乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase，ALS，EC 4.1.3.18)，又称乙酰羟基酸合成酶(Acetohydroxyacid synthase，AHAS)。ALS存在于植物生长的过程中，是诱导支链氨基酸(Ile、Leu、Val)生物合成过程中第一阶段的关键酶。

ALS催化丙酮酸生成乙酰乳酸，乙酰乳酸在一定条件下脱羧生成乙偶姻，乙偶姻在碱性环境下与肌酸和α-萘酚反应生成红色物质，在525nm下有最大吸光值。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、蒸馏水、病、无水乙醇和硫酸铵。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：2~4的比例（建议称取约0.5g到1g组织，加入试剂一定容至2mL），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心20min。取1mL上清，转移至新的2mL EP管中。

2. 在取出的上清中加入约0.5g硫酸铵，充分溶解后4℃静置2h。然后15000g 4℃离心20min，弃掉上清。沉淀中加入0.5mL试剂二，充分溶解冰上待用（若按蛋白浓度计算，则用此粗酶液自行测定蛋白浓度）。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至525nm，可见分光光度计用蒸馏水调零。

4、在1.5mLEP管中按下表步骤加样：

三、乙酰乳酸合成酶活性计算

按样本蛋白浓度计算

单位的定义：37℃每mg组织蛋白每小时催化产生1nmol乙酰乳酸定义为一个酶活力单位。

ALS活性（U/mg prot）= C_标准×∆A_测定÷∆A_标准×V_酶促÷（Cpr×V_样）÷T×F= 2.1×x÷Cpr×F

按样本质量计算

单位的定义：37℃每g组织每小时催化产生1nmol乙酰乳酸定义为一个酶活力单位。

ALS活性（U/g 质量）= C_标准×∆A_测定÷∆A_标准×V_酶促÷（W÷2÷V_提取×V_样）÷T×F= x×2.1÷W×F

V_酶促：37℃反应体系体积，0.42mL；V_提取：加入的试剂三体积，0.5mL；V_样：加入的样本体积，0.2mL；T：37℃反应时间，1h；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2：2mL 样本匀浆取1mL；F：样本稀释倍数。

注意事项：

1、 如果∆A_测定大于1，可以对样品进行稀释或者缩短37℃反应时间；测定吸光值或∆A_测定小于0.01，可以加大样本量或者延长37℃反应时间。最终计算时同步修改计算公式。

实验实例：

称取0.5037g胡萝卜组织，按照前处理步骤操作进行提取酶液，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算∆_测定=A_测定-A_对照=0.308-0.198=0.11，∆A_标准=A_标准-A_标准空白=0.671-0.173=0.498，带入公式计算：

ALS活性（U/g 质量）= 210×∆A_测定÷∆A_标准÷W×F=92.090 U/g 质量

参考文献：

[1] George, MouradJohn, King. Effect of four classes of herbicides on growth and acetolactate-synthase activity in several variants of Arabidopsis thaliana[J]. Planta, 1992, 188(4):491-497.

[2] Hwang I T , Ko Y K ,  Kim T J , et al. Structure–Activity Relationships of Acetolactate Synthase Inhibition among New Benzenesulfonylureas in Rice (Oryza sativa) and Barnyardgrass (Echinochloa crus-galli var. oryzicola)[J]. Pesticide Biochemistry & Physiology, 2000, 68(3):166-172.

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