α-甘露糖苷酶(α-man)活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

货号：BC5040

规格：50T/24S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前每支加入1mL 试剂四溶解，溶解后的试剂在-20℃分装保存，可以保存4周。

2、 标准品：5mmol/L的对硝 基苯*标准液。

产品说明：

α-man分布广泛、种类繁多，在真核生物胞质、内质网、高尔基体、溶酶体中都有发现，不同种类、功能的α-man共同参与N-聚糖的修饰过程。

α-man和特定底物发生反应，其生成物在405nm处有特征吸收峰，根据吸光度的变化率可计算出α-man活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、匀浆器/研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）︰提取液体积(mL)为1︰5~10的比例（建议称取约0.1 g组织，加入1 mL提取液）进行冰浴匀浆，然后12000 g，4℃，离心10 min，取上清置于冰上待测。

2、细胞或细菌：先收集细胞或细菌到离心管内，离心后弃上清；按照细胞或细菌数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000︰1的比例（建议500万个细胞或细菌加入1 mL提取液）进行提取，冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率200 W，超声3秒，间隔7秒，总时间3 min）；然后12000 g，4℃，离心10 min，取上清置于冰上待测。

3、液体：直接检测。若有浑浊可以离心后测定

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30 min以上，调节波长至405 nm，蒸馏水调零。

2、 将5mmol/L的对硝基 苯*标准液用蒸馏水稀释为0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0.01、0.005mmol/L的标准溶液备用。

3、 操作表：(在1.5 mL离心管中)

三、α-甘露糖苷酶(α-man)活性计算

1、 标准曲线的绘制：

以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y＝kx+b，将ΔA带入方程得到x（mmol/L，即μmol/mL）。

2、 α-甘露糖苷酶活性的计算：

（1）按蛋白浓度计算

酶活定义：每mg蛋白每分钟产生1 μmol对-硝基 苯*为1个酶活力单位。

α-甘露糖苷酶酶活（U/mg prot）= x× V样÷（V样×Cpr）÷T×F= x×0.1÷ Cpr ×F

（2）按样本质量计算

酶活定义：每g样本每分钟产生1 μmol对-硝基 苯*为1个酶活力单位。

α-甘露糖苷酶酶活（U/g质量）= x× V样÷（W×V样÷V提取）÷T×F= x×0.1÷W×F

（3）按照细胞或细菌数量计算

酶活定义：每10⁴个细胞每分钟产生1 μmol对-硝基 苯*为1个酶活力单位。

α-甘露糖苷酶酶活（U/10⁴ cell）= x× V样÷（细胞数量×V样÷V提取）÷细胞数量（万个）÷T×F
= x×0.1÷ 细胞数量（万个）×F

（4）按液体体积计算

酶活定义：每mL样本每分钟产生1 μmol对-硝基 苯*为1个酶活力单位。

α-甘露糖苷酶酶活（U/mL）＝x×V样÷V样÷T×F= x×0.1×F

V提取：提取液体积，1 mL；V样：加入的样本体积，0.125 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间，10 min； F：稀释倍数。

注意事项：

1、如果测定吸光值A＞1.5或ΔA＞1，建议稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数；如果测定吸光值较低或接近空白OD值，建议增加样本量后再进行测定。

实验实例：

1、 称取0.1 g兔子肝脏组织，加入1 mL提取液，冰浴匀浆，12000 g，4℃条件下离心10 min；取上清置于冰上待测。使用1mL玻璃比色皿按照测定步骤操作，计算ΔA=A测定管-A对照管=0.404-0.309=0.095，标准曲线y=2.0294x+ 0.0092，计算x=0.0422，按公式计算活性：

α-甘露糖苷酶酶活（U/g 质量）= x×0.1÷W×F = 0.0422U/g质量

2、 称取0.1 g草莓果肉，加入1 mL提取液，冰浴匀浆，12000 g，4℃条件下离心10 min；取上清置于冰上待测。使用1mL玻璃比色皿按照测定步骤操作，计算ΔA=A测定管-A对照管=0.113-0.091=0.022，标准曲线y=2.0294x+ 0.0092，计算x=0.0063，按公式计算活性：

α-甘露糖苷酶酶活（U/g 质量）= x×0.1÷W×F = 0.0063 U/g质量

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