土壤碳酸酐酶（S-CA）活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

货号：BC5500

规格：50T/24S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前取一支试剂二，先加入1mL丙酮使粉剂充分溶解，再加入10mL蒸馏水。未用完的试剂分装保存，-20℃可以分装保存1周，避免反复冻融。

2、 标准品：5μmol/mL 酚标准液。临用前取50μL的5μmol/mL 酚标准液于试剂瓶中，加入750μL蒸馏水充分混合，配置成0.3125 μmol/mL的酚标准液。

产品说明：

碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase, CA, EC4.2.1.1）是一种以 Zn²⁺为活性中心的金属酶，可用来高效催化 CO₂ 的可逆水合反应：CO₂+H₂0⇋HCO₃^-+H⁺，催化速率可达自然条件下的10⁷倍，是目前已知催化速率最快的酶之一。

碳酸酐酶可催化乙酸对硝基苯酯反应生成对硝基苯*，通过检测405nm处吸光值上升速率反映碳酸酐酶活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅/恒温培养箱、30-50目筛、研钵、分析天平、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、甲苯、蒸馏水和冰。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

新鲜土样自然风干或 37℃烘箱风干，过 30~50目筛。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至405nm，蒸馏水调零。

2、 试剂一使用前37℃预热15min。

3、 标准管测定

（1） 标准管测定：在2mL EP管内中加入320μL标准液，1180μL试剂一，充分混匀后，于1mL玻璃比色皿中测定405nm处吸光值，记作A_标准。

（2） 标准空白管测定：在2mL EP管内中加入320μL蒸馏水，1180μL试剂一，充分混匀后，于1mL玻璃比色皿中测定405nm处吸光值，记作A_标准空白。

（3） 计算∆A_标准=A_标准-A_标准空白。（标准管和标准空白管只需做1-2次。）

4、 操作表：（在2mLEP管内加入）

三、土壤CA活性计算

按样本质量计算

单位的定义：37℃，每g土壤每分钟催化产生1μmol 对硝基苯*定义为一个酶活力单位。

S-CA活性（U/g 质量）=C_标×∆A÷∆A_标准×V_标准÷W÷T×F=0.02×∆A÷∆A_标准÷W×F

C_标：标准品浓度，0.3125μmol/mL；V_标准：反应体系中加入的标准液体积，0.32mL；T：反应时间，5min； W：样本质量，g；F：样本稀释倍数。

注意事项：

1、 如果A测定大于1.5或者∆A大于0.8，可以减少样本量或者缩短37℃酶促反应时间；∆A小于0.02，可以加大样本量或者延长37℃酶促反应时间。注意计算时同步修改计算公式。

2、 如果离心后待测的上清依然浑浊，可尝试加大离心转速或延长时间，例如20000g，4℃离心10min。

实验实例：

1、 称取0.2014g土壤样本65号，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算∆A =A_测定-A_对照=0.595-0.400=0.195，∆A_标准=A_标准-A_标准空白=0.448-0=0.448，带入公式计算：

S-CA活性（U/g 质量）=0.02×∆A÷∆A_标准÷W×F =0.043 U/g 质量

2、 称取0.2015g土壤样本1号，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算∆A =A_测定-A_对照=0.275-0.137=0.138，∆A_标准=A_标准-A_标准空白=0.448-0=0.448，带入公式计算：

S-CA活性（U/g 质量）=0.02×∆A÷∆A_标准÷W×F =0.031 U/g 质量

参考文献：

[1] Li W, Yu L J, Yuan D X, et al. A study of the activity and ecological significance of carbonic anhydrase from soil and its microbes from different karst ecosystems of Southwest China[J]. Plant and Soil, 2005, 272(1):133-141.

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