土壤丙酮酸（S-PA）含量检测试剂盒（酶法）说明书

                                               可见分光光度法

货号：BC5530

规格：50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入3.6mL蒸馏水充分溶解，分装保存，-20℃可以保存4周，避免反复冻融。

2、 试剂三：临用前按试剂三：蒸馏水=10μL：1mL（共1.01mL，约13T）的比例进行稀释，现用现配。

3、 标准品：20μmol/mL丙酮酸钠标准液。

产品说明：

丙酮酸通过乙酰CoA连接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代谢，起着重要的枢纽作用。

在pH=7.5时，丙酮酸在LDH的催化作用下与NADH反应，生成NAD ⁺和乳酸。在1-mPMS作用下，WST-1可与NADH反应，产生水溶性Formazan。通过检测450nm条件下吸光值，可以计算出丙酮酸含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、研钵、超声清洗仪、30-50目筛和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

新鲜土样自然风干或37℃烘箱风干，过30~50目筛。

称取风干混匀土样约0.1g，加入1mL蒸馏水混匀；然后置于超声清洗仪常温超声30min。然后12000g，常温离心10min，取上清液待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长到450nm，蒸馏水调零。

2、 试剂一37℃预热20min以上。

3、 标准品的制备：将20μmol/mL丙酮酸钠标准液用蒸馏水稀释得到0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μmol/mL标准溶液备用。

4、 标准品稀释表：

实验中每个标准管需100µL标准溶液。

5、 操作表：(在1.5mLEP管中加入下列试剂)

三、土壤丙酮酸含量计算

1、标准曲线绘制：

根据标准管的浓度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA_标准（y，ΔA_标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA_测定代入方程得到x（μmol/mL）。

2、土壤丙酮酸含量计算：

土壤丙酮酸含量（μmol/g 质量）= x×V样÷(V样÷V提×W) = x÷W

V样：加入的样本体积，0.1mL；V提：前处理中加入蒸馏水的体积，1mL；W：样本质量，g。

注意事项：

1. 如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者用蒸馏水稀释样本后再进行测定。

实验实例：

1、 称取约0.103g花盆土，加入1mL蒸馏水，超声破碎30min，10000g，常温离心10min，取上清待测。之后按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA_测定= A_空白-（A_测定-A_对照）=0.843-（0.493-0.028）=0.378，标曲y=1.4576x-0.0002，R²=0.9924，x=0.2595µmol/mL, 计算丙酮酸含量得：

丙酮酸含量（µmol/g 质量）= x×V样 ÷(V样÷V提×W) = x÷W =2.5191µmol/g 质量。

2、 称取约0.101g污泥，加入1mL蒸馏水，超声破碎30min，10000g，常温离心10min，取上清待测。之后按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA_测定= A_空白-（A_测定-A_对照）=0.843-（0.528-0.135）=0.450，标曲y=1.4576x-0.0002，R²=0.9924，x=0.3089µmol/mL, 计算丙酮酸含量得：

丙酮酸含量（µmol/g 质量）= x×V样 ÷(V样÷V提×W) = x÷W =3.0581µmol/g 质量。

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