丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC5855

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入1.1mL蒸馏水充分溶解，未用完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

2、 试剂四：临用前加入1.1mL蒸馏水充分溶解，未用完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

3、 试剂五：临用前加入1.25mL蒸馏水充分溶解，未用完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

4、 试剂六工作液：临用根据样本量按照试剂六：蒸馏水=5μL：120μL（共125μL，25T）的比例配制成，现配现用。

5、 工作液的配制：临用前按样本量将试剂二：试剂三：试剂四：试剂五：试剂六工作液=0.25mL：0.25mL：0.25mL：0.25mL：0.25mL（共1.25mL，约25T）配制成工作液使用，现配现用。

产品说明：

丙酮酸磷酸双激酶（pyruvate phosphate dikinase，PPDK，EC 2.7.9.1）是C4途径和景天科酸代谢途径的限速酶，催化ATP、丙酮酸和Pi经三步反应生成磷酸烯醇式丙酮酸。该酶主要存在于C4植物的叶绿体基质中，对光合功能具有重要调节作用。

PPDK的逆向反应催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、AMP和PPi生成丙酮酸、ATP和Pi，乳酸脱氢酶（LDH）进一步催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD⁺，在340nm测定NADH减少速率，据此可以计算PPDK活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、天平、低温离心机、水浴锅、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）

进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心 10min，取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，分光光度计用蒸馏水调零。

2、 试剂一37℃预热10min.

3、 操作表：（在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入）

三、丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）计算公式

1. 使用96孔UV板测定：

（1） 按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟减少1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PPDK活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反×10⁹÷（Cpr×V样）÷T×F =535.91×ΔA÷Cpr×F

（2） 按样本质量计算：

酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟减少1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PPDK活性（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V反×10⁹÷（W÷V提取×V样）÷T×F =535.91×ΔA÷W×F

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/(mol·cm)；d：96孔板光径，0.6cm；V反：反应体系体积，2×10^-4L；V样：反应体系中加入的样本体积，0.02mL；V提取：加入提取液的体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；F：稀释倍数；10⁹：单位换算，1mol=10⁹nmol。

2. 使用微量比色皿测定：

将上述公式中的d=0.6cm改为d=1cm（微量比色皿光径）进行计算即可。

注意事项：

1. 测定过程中样本和工作液在冰上放置，以免变性和失活。

2. 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

3. 当样本ΔA＜0.005时，可适当延长酶促反应时间或增大样本量后测定；当样本ΔA>0.6时，可用蒸馏水稀释上清液后测定，注意同步修改计算公式中的稀释倍数。

实验实例：

1、 取0.1014g高粱叶片加入1mL提取液进行冰浴匀浆，取上清用蒸馏水稀释4倍后，按照测定步骤操作，用96孔UV板测得ΔA空白=A空白1-A空白2=0.754-0.749=0.005，ΔA测定=A测定1-A测定2=0.811-0.478=0.333，ΔA=ΔA测定-ΔA空白=0.333-0.005=0.328，按样本质量计算PPDK活性得：

PPDK活性（U/g 质量）=535.91×ΔA÷W×F =6934.06 U/g 质量。

2、 取0.1086g柚子叶片加入1mL提取液进行冰浴匀浆，取上清后按照测定步骤操作，用96孔UV板测得ΔA空白=A空白1-A空白2=0.754-0.749=0.005，ΔA测定=A测定1-A测定2=1.849-1.530=0.319，ΔA=ΔA测定-ΔA空白=0.319-0.005=0.314，按样本质量计算PPDK活性得：

PPDK活性（U/g 质量）= 535.91×ΔA÷W×F =1549.50U/g 质量。

参考文献：

[1] Chris J. Chastain and others, Functional evolution of C4 pyruvate, orthophosphate dikinase, Journal of Experimental Botany, Volume 62, Issue 9, May 2011, Pages 3083–3091

[2] Chastain, C.J., Heck, J.W., Colquhoun, T.A. et al. Posttranslational regulation of pyruvate, orthophosphate dikinase in developing rice (Oryza sativa) seeds. Planta 224, 924–934 (2006).

[3] Aoyagi K, Bassham JA. Pyruvate orthophosphate dikinase in wheat leaves. Plant Physiol. 1983 Nov;73(3):853-4.

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