丁酰胆*酯酶（BchE）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC5975

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前加入12mL试剂一，充分溶解，-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

产品说明：

丁酰胆*酯酶（Butyrylcholinesterase，BchE，EC3.1.1.8），又称血浆胆*酯酶，假性胆*酯酶，是一种*酸水解酶，由肝脏合成后进入血液，几乎存在于所有动物组织中。BchE结构与乙酰胆*酯酶（AchE）相似，但底物特异性和抑制剂敏感性不同。与AchE相比，BchE能够有效水解较大的胆*酯，如丁酰胆*和苯甲酰胆*，而且可以清除有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药等神经毒剂的毒害作用。有研究表明，BchE可作为阿尔茨海默病治疗的重要靶点。

BchE催化丁酰胆*水解生成胆*，胆*与二硫对硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在412nm处有吸收峰，通过测定412nm吸光度增加速率，计算BchE活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、分析天平、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织样本：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）=1：5~10比例加入试剂一（建议称取0.1g样本，加入1.0mL试剂一），冰浴匀浆后，于4℃，12000rpm离心10min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

2. 血清/血浆等液体样本：直接测定。若有浑浊请离心后取上清置于冰上待测。

3. 细菌、细胞：按照细胞数量10⁴个：试剂一体积（mL）500~1000:1的比例（建议500万细胞加入1 mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3 min），于4℃，12000rpm离心10min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

二、 测定步骤

1．可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，分光光度计蒸馏水调零。

2．操作表：（在微量玻璃比色皿/96孔板中加入下列试剂）

三、BchE活性计算

A、用微量玻璃比色皿测定：

1. 按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每mg蛋白每分钟催化产生1nmol TNB为1个酶活单位。

BchE活性(U/mg prot)=[ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹] ÷（Cpr×V样）÷T×F=308.8×ΔA÷Cpr×F。

2. 按照样本质量计算

活性单位定义：每g组织每分钟催化产生1nmol TNB为1个酶活单位。

BchE活性(U/g 质量)=[ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹]÷（W×V样÷V样总）÷T×F=308.8×ΔA÷W×F。

3. 按照血清/血浆等液体体积计算

活性单位定义：每mL血清/血浆每分钟催化产生1nmol TNB为1个酶活单位。

BchE活性(U/mL)=[ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹]÷V样÷T×F=308.8×ΔA×F。

4. 按细菌/细胞数量计算

活性单位定义：每万个细胞每分钟催化产生1nmol TNB为1个酶活单位。

BchE活性(U/10⁴ cell)=[ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹]÷（N×V样÷V样总）÷T×F=308.8×ΔA÷N×F

ε：TNB摩尔消光系数，13.6×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，0.21mL=2.1×10^-4L；10⁹：单位换算系数，1mol=1×10⁹nmol；V样：反应体系加入样本体积，0.01mL；V样总：加入试剂一体积，1mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，5min；F：样本稀释倍数；N：细菌/细胞数量，以万计。

B、用96孔板测定：

将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算即可。

注意事项：

1. 为保证结果准确，请严格控制反应时间，建议两人进行实验，一人加样，一人计时。

2. 如果∆A测定接近∆A空白，可以增加样本量后再进行测定；如果A2测定大于1或ΔA测定大于0.7，建议将样本上清用试剂一适当稀释后再进行测定。注意同步修改计算公式。

实验实例：

1. 取0.1018g大鼠肝脏样本，加入1mL试剂一进行冰浴匀浆，离心后上清液用试剂一稀释2倍，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算：ΔA测定=A测定2-A测定1=0.636-0.417=0.219，ΔA空白=A空白2-A空白1=0.188- 0.180= 0.008，ΔA=ΔA测定-ΔA空白=0.211，按样本质量计算得（光径为0.6cm带入计算）：

BchE活性（U/g 质量）=[ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹]÷（W×V样÷V样总）÷T×F =2133.49 U/g 质量。

2. 取人血清样本，用试剂一稀释16倍，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算：ΔA测定=A测定2-A测定1=0.960- 0.299=0.661，ΔA空白=A空白2-A空白1=0.188- 0.180=0.008，ΔA=ΔA测定-ΔA空白=0.653，按液体体积计算得（光径为0.6cm带入计算）：

BchE活性（U/mL）=[ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹]÷V样÷T×F =5377.237 U/mL。

参考文献：

[1] Ellman GL, Courtney KD, Andres V Jr. et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity [J]. Biochemical Pharmacology, 1961, 7(2): 88-95.

[2] Yücel YY, Tacal O, Ozer I. Comparative effects of cationic triarylmethane, phenoxazine and phenothiazine dyes on horse serum butyrylcholinesterase [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2008, 478(2): 201-205.

[3] Jońca J, Żuk M, Wasąg B. et al. New Insights into Butyrylcholinesterase Activity Assay: Serum Dilution Factor as a Crucial Parameter [J]. PLoS ONE, 2015, 10(10).

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