Bst 4.0 Basic Mix(with UDG)

商品属性：

该制品为双组分的试剂，Basic Buffer Mix 包含了反应缓冲液、Mg2+、dU/A/C/GTP(不含 dTTP)、冻干赋形剂，酶 Mix 包含 Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶、热敏 UDG。得益于 Bst 4.0 识别 dUTP 底物，反应底物中不包含dTTP，因此扩增产物均为 dUTP 产物，在配合热敏 UDG的情况下，实现防污染性能。在实际测试中，含有 10e5Copies 的污染物的条件下，抑制污染扩增。本制品尤其适用于开盖的 LAMP 反应（如试纸条检测）、密封腔体（污染风险较高）的检测试验（如定量 PCR腔体）。
试剂使用特点：
（1）Basic Buffer Mix 中不含染料，可自行添加 SYBR Green、Eva Green 等染料进行荧光检测。
（2）本试剂适用于开盖检测如核酸试纸条检测。
（3）试剂中含有冻干赋形剂，试剂可直接冻干，无需再优化冻干配方。

储存：-20℃保存 1 年；-80℃保存 2 年；短期使用放置于2-8℃，保存 1 个月。反复冻融 10 次，不影响使用。如有白色沉淀，于 37℃水浴放置 10min 后溶解沉淀，不影响使用。
使用方法：
1. 配制 LAMP 反应体系
2.5xBst4.0 Basic BufferMix 10 μl
25xBst4.0/UDG Enzyme 1 μl
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到总体积 25 μl
10xLAMP Primer Mix 浓度：FIP/BIP 分别为 16 μM、LoopF/B 分别为 4~8 μM、F3/B3 分别为 2 μM。
注意：如何应用核酸试纸条进行特异性检测，可来信咨询。
2. 反应体系配好后，室温（25-37°C）放置 2min，以消化去除潜在的核酸污染，随后置于 65°C 进行反应15~30min。
试剂冻干策略（有冻干经验人员操作）：
1. 配制 LAMP 冻干体系
2.5xBst4.0 Basic BufferMix 10 μl
25xBst4.0/UDG Enzyme 1 μl
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
ddH2O 到体积 1.5 μl
冻干总体积 15 μl
2. 体系配制完毕后，加入 0.2 ml EP 管进行上机冻干。该试剂的冻干体积为 15 μl， 检测反应体积为 25 μl。

特别说明：
（1）本试剂防污染原理为：热敏 UDG 消化去除含有 dUTP的扩增产物，热敏 UDG 在随后 50℃以上迅速失活，并不影响后续 LAMP 扩增。因此，本试剂无法去除采用 dTTP扩增的污染物，也不能消化天然的核酸底物（DNA/RNA）。为避免扩增气溶胶污染，实验室应长期使用本试剂进行实验，一旦使用 dTTP 试剂扩增后，造成实验室污染，采用本试剂不会消除假阳性扩增。
（2）本试剂适用基于 OG 染料变色法、SYBR Green 法、基于 Biotin/FAM 探针的核酸胶体金法（ 具有胶体金法特异性使用策略，如需技术支持，请来信咨询）。本试剂不支持 HNB、pH 显色法。其它使用策略自行优化调整。
（3）基于本试剂， 提供冻干制备服务。八联管起订量 480T，冻干球起订量 2000T。

PCR基本步骤及注意事项？

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而体外PCR反应同样需要类似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境；反应过程同生物体内一样，DNA双链打开，引物结合模板，延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链，而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链，在退火温度处引物结合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子，进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、主要的成分

1.模板可以是多种形式，主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物，cDNA等，但不能为RNA。对于不同类型的模板，其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够，质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA，但仍可做PCR的模板，只不过在第一轮循环时只有一个引物结合，合成另一条链。从第二轮开始，两个引物均与特异位点结合，从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增，原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶，只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说，一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂，提取的浓度也往往比较大，为防止浓度过大对PCR造成影响，故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单，且提取浓度一般较低，则无需稀释。

PCR实验中应该注意的问题有哪些?

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);

2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;

3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;

4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;

5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

ct值过晚

在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。

因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;

2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);

3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;

4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;

5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

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