500ml 上海曼贤实验仪器生产加工半微量定氮蒸馏装置含主要部件主反应室

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以下资料仅供参考：

蛋白质的定量测定（一）--凯氏定氮法

目的要求

（1）学习微量凯氏定氮法的原理。

（2）掌握微量凯氏定氮法的操作方法。

实验原理

生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被*为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下：

1. 消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。

2. 加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH（浓）作用生成（NH4）OH, 加热后生成NH3, 通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被吸收。

3. 滴定：用过量标准HCl吸收NH3，剩余的酸可用标准NaOH滴定，由所用HCl摩尔数减去滴定耗去的NaOH摩尔数，即为被吸收的NH3摩尔数。此法为回滴法，采用甲基红卫指示剂。HCl＋NaOHNaCl +H2O

本法适用于0.2 ~ 2.0 mg的氮量测定。

1.热源 2. 烧瓶 3. 玻璃管 4. 橡皮管5．玻璃杯 6. 棒状玻塞 7. 反应室 8. 反应室外壳 9. 夹子 10. 反应室中插管 11. 冷凝管 12. 锥形瓶 13. 石棉网

图3.4 微量凯氏蒸馏装置示意图

 试剂和器材

一、试剂

浓硫酸；30％过氧化氢溶液；10 M氢氧化钠；0.01M的标准盐酸；标准硫酸铵（0.3mg氮/mL）。

催化剂：硫酸铜：硫酸钾＝1：4混合，研细。

指示剂：0.1％甲基红乙醇溶液。

二、测试样品

牛血清白蛋白。

三、器材

微量凯氏定氮仪；移液管1mL（×3）；2mL（×1）；微量滴定管5mL（×1）; 烧杯200mL（×2）；量筒10mL（×1）；三角烧瓶150mL（×4）；凯氏烧瓶50mL（×4），吸耳球（×1）；电炉；分析天平。

操作方法

一、样品处理

称取牛血清白蛋白50mg，加入2个凯氏烧瓶中，另2个凯氏烧瓶为空白对照，不加样品。分别在每个凯氏烧瓶中加入约500mg硫酸钾－硫酸铜混合物，再加5 mL浓硫酸。

二、消化

将以上4个凯氏烧瓶置于通风橱中电炉上加热。在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化,使瓶内液体微微沸腾，大约维持2 ~ 3h。待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧瓶取下，稍冷，将30％过氧化氢溶液1 ~ 2滴加到烧瓶底部消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成透明淡蓝绿色，消化即告完成。冷却后将瓶中的消化液倒入50mL容量瓶中，并以蒸馏水洗涤烧瓶数次，将洗液并入容量瓶中，定容备用。

三、蒸馏

1. 蒸馏器的洗涤

蒸气发生器中盛有加有数滴H2SO4的蒸馏水和数粒沸石。加热后，产生的蒸汽经贮液管、反应室至冷凝管，冷凝液体流入接受瓶。每次使用前，需用蒸汽洗涤10分钟左右（此时可用一小烧杯承接冷凝水）。将一只盛有5mL 2％硼酸液和1 ~ 2滴指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液体中，继续蒸馏1 ~ 2分钟，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净。

2. 消化样品及空白的蒸馏

取50mL 锥形瓶数个，各加25mL 0.01M标准HCl和1 ~ 2滴指示剂，用表面皿覆盖备用。

取2mL 稀释消化液，由小漏斗加入反应室。将一个装有0.01M标准HCl和指示剂的锥形瓶放在冷凝管下，使冷凝器管口下端浸没在液体内。

用小量筒量取5mL 10M NaOH溶液，倒入小漏斗，让NaOH溶液缓慢流入反应室。尚未*尽时，加紧夹子，向小漏斗加入约5mL蒸馏水，同样缓缓放入反应室，并留少量水在漏斗内作水封。加热水蒸气发生器，沸腾后，关闭收集器活塞。使蒸汽冲入蒸馏瓶内，反应生成的NH3逸出被吸收。待氨已蒸馏*，移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，并用少量蒸馏水冷凝管口。取下锥形瓶，以0.01M NaOH标准溶液滴定。记下所耗去的体积。

3. 蒸馏后蒸馏器的洗涤

蒸馏完毕后，移取热源，夹紧蒸汽发生器和收集器间的橡皮管，此时由于收集器温度突然下降，即可将反应室残液吸至收集器。

• 标准样品的测定

在蒸馏样品及空白前，为了练习蒸馏和滴定操作，可用标准硫酸铵试做实验2 ~ 3次。

标准硫酸铵的含氮量是0.3mg/mL，每次实验取2.0mL。

四、计算

样品的含氮量（mg/mL）=

若测定的蛋白质含氮部分只是蛋白质（如血清），则：

样品中蛋白质含量（mg/mL）＝

式中：A为滴定空白用去的NaOH平均mL数，B为滴定样品用去的NaOH平均mL数，V为样品的mL数，0.01 NaOH的摩尔浓度，14为氮的原子量，6.25为系数（蛋白质的平均含氮量为16％，由凯氏定氮法测出含氮量，再乘以系数6.25即为蛋白质量），N为样品的稀释倍数。

注意事项

（1）必须仔细检查凯氏定氮仪的各个连接处，保证不漏气。

（2）凯氏定氮仪必须事先反复清洗，保证洁净。

（3）小心加样，切勿使样品沾污口部、颈部。

（4）消化时，须斜放凯氏烧瓶（45o左右）。火力先小后大，避免黑色消化物溅到瓶口、瓶颈壁上。

（5）蒸馏时，小心加入消化液。加样时将火力拧小或撤去。蒸馏时，切记火力不稳，否则将发生倒吸现象。

（6）蒸馏后应及时清洗定氮仪。