11204ES03 Hieff qPCR SYBR Green Mix(实时荧光定量)
- 公司名称 翌圣生物科技(上海)股份有限公司
- 品牌 Yeasen/翌圣生物
- 型号 11204ES03
- 产地 上海
- 厂商性质 生产厂家
- 更新时间 2022/11/7 16:59:45
- 访问次数 1057
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供货周期 | 现货 | 规格 | 1ml |
---|---|---|---|
货号 | 11204ES03 | 应用领域 | 医疗卫生,化工,生物产业 |
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格(元) |
Hieff® Hieff qPCR SYBR Green Mix(实时荧光定量) (Rox Provided Seperately) | 11204ES03 | 1 mL | 185.00 |
11204ES08 | 5×1 mL | 745.00 | |
11204ES50 | 50×1 mL | 6755.00 | |
11204ES60 | 100×1 mL | 12755.00 |
产品描述
Hieff® Hieff qPCR SYBR Green Mix(实时荧光定量) (Rox Provided Seperately)是2×实时定量PCR扩增的预混合溶液。Mix中含有热启动Hieff® DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+。使用时,仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR,大大简化操作过程,降低污染几率。本产品针对不同型号的实时荧光定量PCR仪,分别提供不同浓度的 Rox 参比液(High Rox/Low Rox),用于校正孔与孔之间的荧光信号误差。
本品采用的DNA聚合酶配体可以随温度变化实时调节DNA聚合酶活性。配方添加了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子,使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。
产品组分
组分编号 | 组分名称 | 产品编号/规格 | |||
11204ES03 (1 mL) | 11204ES08 (5×1 mL) | 11204ES50(50×1 mL) | 11204ES60(100×1 mL) | ||
11204-A | Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix | 1 mL | 5 ×1 mL | 50 ×1 mL | 100 ×1 mL |
11204-B | 50×Low Rox | 40 μL | 200 μL | 4 ×500 μL | 8 ×500 μL |
11204-C | 50×High Rox | 40 μL | 200 μL | 4 ×500 μL | 8 ×500 μL |
运输与保存方式
冰袋运输。-20℃避光储存,有效期18个月。
本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料SYBR® Green I,保存或配制反应体系时需避免强光照射。
注意事项
1. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒(货号:11123ES),以有效去除RNA样品中残留的基因组。
2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
3. 本产品仅作科研用途!
反应体系(推荐冰上配制)
【注】: 使用前务必充分混匀,避免剧烈震荡产生过多气泡。
a) 参比染料:Rox的添加,可根据不同仪器型号进行选择,具体可参考【适用机型】。
b) 引物浓度:通常引物终浓度为0.2 μM,也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。
c) 模板浓度:如模板类型为未稀释cDNA原液,使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。
d) 模板稀释:cDNA原液建议5-10倍稀释,最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。
e) 反应体系:推荐使用20 μL或50 μL,以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
f) 体系配制:请于超净工作台内配制,并使用无核酸酶残留的枪头、反应管;推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。
扩增程序
三步法程序 两步法程序
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | |
预变性 | 95℃ | 5 min | 1 | 预变性 | 95℃ | 5 min | 1 | |
变性 | 95℃ | 10 sec | 40 | 变性 | 95℃ | 10 sec | ||
退火 | 55-60℃ | 20 sec | 退火、延伸 | 60℃ | 30 sec★ | 40 | ||
延伸 | 72℃ | 20 sec★ | ||||||
熔解曲线 | 仪器默认设置 | 1 | 熔解曲线 | 仪器默认设置 | 1 |
【注】:高特异性可选择两步法,高效率扩增可选择三步法。
a) 预变性时间:根据不同模板和引物的具体情况可适当缩短至2 min。
b) 退火温度和时间:请根据引物和目的基因的长度进行调整。
c) 荧光信号采集(★):请参考仪器说明书设置。
d) 熔解曲线:通常情况下可以使用仪器默认程序。
结果分析
定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。
1) 扩增曲线:标准扩增曲线为S型。
Ct值小于10,需要将稀释模板后,重新进行实验;
Ct值介于30-35之间时,需要提高模板浓度,或者增大反应体系的体积,以提高扩增效率,保证结果分析的准确性;
Ct值大于35时,检测结果无法定量分析基因的表达量,但可用于定性分析。
2) 熔解曲线:
熔解曲线单峰,表明反应特异性好可以进行定量结果分析;若熔解曲线出现双峰或者多峰,则不能进行定量分析。
熔解曲线出现双峰,需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。
如果是引物二聚体,建议降低引物浓度,或者重新设计扩增效率高的引物。
如果是非特异性扩增,请提高退火温度,或者重新设计更高特异性的引物。
引物设计指南
1)推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳,可以在100 bp-300 bp内选择。
2)正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60ºC-65ºC为佳。
3)引物碱基分布要均匀,避免出现连续的4个相同碱基,GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。
4)引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。
5)引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。
6)设计完成的引物需要进行扩增效率的检测,只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。
适用机型
High Rox适用机型: ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus;
Low Rox 适用机型: ABI 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio6,7,12k Flex; Stratagene MX3000P, MX3005P, MX4000P;
不需要Rox校正的仪器型号:
Bio-Rad CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;
Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;
Roche Applied Science LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96; Thermo Scientific PikoReal Cycler;
Cepheid SmartCycler; Illumina Eco qPCR.
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