货号W0511/Plasmid Mini Kit质粒小提试剂盒

保存：RNaseA ，2-8℃
      其他组分，室 温
组分说明
KitSize 50 200
BufferP1 15ml 60ml
BufferP2 15ml 60ml
BufferN3 20ml 80ml
BufferPS 15ml 60ml
BufferPW（concentrate） 15ml 50ml
BufferEB 10ml 30ml
RNaseA（10mg/ml） 150μl 600μl
SpinColumnCM 50 200
CollectionTube（2ml） 50 200
产品简介
    本试剂盒提供一种简单快捷提取质粒的方法，快速获得大量的质粒DNA。采用碱裂解法裂解细胞，新型硅基质膜高
效专一性结合质粒DNA，*的缓冲液系统洗去杂质，无需酚抽提和乙醇沉淀。本试剂盒在保证提取量和纯度的前提下，
大大简化提取步骤，可从1-5 ml菌液中纯化多达30 μg的高拷贝质粒DNA。得到的DNA可直接用于PCR、酶切、测序、
转化等生物学实验。
注意事项
1. BufferP1 在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的RNaseA 全部加入），混匀，置于2–8℃保存。
2. *次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在 BufferPW 中加入无水乙醇。
3. 使用前请检查 BufferP2、BufferN3 是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀现象，可在37℃水浴几分钟，即可
恢复澄清。
4. 注意不要直接接触 BufferP2 和BufferN3，使用后应立即盖紧盖子。
5. 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。
6. 所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心。
自备：无水乙醇，离心管


操作步骤
1.  取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管（自备）中，12,000rpm（~13,400×g）离心1分钟，尽量吸弃上清。
注意：如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10 kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加BufferP1、P2、N3的用量；洗脱缓冲液推
荐在65~70℃水浴中预热；可以适当延长吸附和洗脱时间，以提高提取效率。
2. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250μlBufferP1（使用前请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡
器*悬浮细菌沉淀。
  注意：如果菌块未*混匀，将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低。
3. 向离心管中加入250μlBufferP2，温和地上下颠倒混匀4-6次，使菌体充分裂解，此时菌液应变得清亮粘稠。所用
时间不应超过5分钟，以免质粒受到破坏。
     注意：不要剧烈震荡，以免造成所提质粒中出现基因组DNA污染。如果溶液未变得清亮，提示可能菌量过大，裂解不*，应减少菌体量。
4.  向离心管中加入350μlBufferN3，立即温和地上下颠倒混匀4-6次，此时将出现白色絮状沉淀，12,000rpm离心10
分钟，此时在离心管底部形成沉淀。
注意：BufferN3加入后应立即充分混匀，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
5. 柱平衡：向已装入收集管（CollectionTube）的吸附柱（SpinColumnCM）中加入200 μlBufferPS，12,000rpm
离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6. 将步骤4中所得上清加入到已装入收集管的吸附柱中，注意不要吸出沉淀，12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的
废液，将吸附柱放回收集管中。
7. 向收集管中加入600μlBufferPW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
8. 重复步骤7。
9. 将吸附柱重新放回收集管中，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以*晾干。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。
10. 将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-100μlBufferEB，室温放置数分钟，12,000rpm
离心1分钟，将质粒溶液收集到离心管中。-20℃保存质粒。
注意：1）为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤10。BufferEB在65-70℃水浴预热，适当延长吸附和
洗脱时间，可以增加提取效率。
2）洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），
pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小会影响回收效率。
3）如果使用TE洗脱，需要考虑其中含有的EDTA是否会影响后续的酶促反应。