质粒DNA的分离、纯化和鉴定 (二)

材料、设备及试剂
　　 一、材料
　　 含pBS的E. coli DH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心管架。
　　 二、设备
　　 微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 骏逸台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器， 电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等。
　　 三、试剂
　　 1、 LB液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5, 加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。
　　 2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。
　　 3、 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液, -20℃保存备用。
　　 4、 溶菌酶溶液： 用10mmol/L Tris?Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。
　　 5、 3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml水中溶解40.81g NaAc?3H2 O,用冰醋酸调pH至5.2, 加水定容至100ml, 分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。
　　 6、 溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。
　　 7、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (临用前用10mol/L NaOH母液稀释)，1％ SDS。
　　 8、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。
　　 9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L Tris?Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20℃。
　　 10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/L Tris?Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris?Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,因为酸性条件下DNA会分配于有机相。
　　 11、 氯仿:按氯仿:异戊醇＝24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。 　　按体积/体积＝1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。
　　 12、 TE缓冲液：10 mmo/L Tris?Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。
　　 13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris?Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% Triton X-100。
　　 14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris?Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。
　　 15、 电泳所用试剂： （1） TBE 缓冲液 (5×)：称取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。 （2）上样缓冲液 (6×)：0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。
 

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