蛋白质的分离与纯化

蛋白质的分离与纯化

蛋白质分离纯化的基本流程

 选择材料和预处理 细胞的破碎及细胞器的分离 蛋白质的抽提 蛋白质的纯化 浓缩、干燥和保存

一、材料的选择和预处理

 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目

的来确定。

 从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。

 对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先除去结缔组织和

脂肪组织。

 对预处理好的材料，若不立即进行实验， 应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应

选用新鲜材料制备。

二、细胞的破碎

（一）机械方法：主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。

 高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），适用于动物内脏组织的破碎。

 玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料；也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度比高速捣碎机高，机械

切力对分子破坏较小。

 小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。

（二）物理方法：主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎。

 反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

 超声波法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料；只要有设备，该法方便且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。

 （三）化学及生物化学法

 有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等使细胞膜破坏； 细菌细胞壁较厚，采用溶菌酶处理效果更好。此外一些细胞膜较脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞胀破。

 细胞器的分离

 制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料， 或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子，防止其他细胞组分的干扰，细胞破碎后常将细胞内各组分先行分离，以便于获得更好的分离效果。

 细胞器的分离一般采用差速离心法

 细胞经过破碎后，在适当介质中进行差速离心。利用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得所需组分。

 细胞器的分离制备，介质的选择现一般用蔗糖、Ficoll或葡萄糖-聚乙二醇等溶液。

三、蛋白质的提取

 提取是将经过预处理或破碎了的细胞或组织置于一定条件下的溶剂中，让被提取的蛋白质以溶解状态充分地释放出来，并尽可能保持原来的天然状态，不丢失生物活性的过程。

 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质。

 抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。

 膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂，使膜结构破坏，利于蛋白质

与膜分离。

 在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。

水溶液提取法

 大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，因此蛋白质的提取一般以水为主。稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也是提取蛋白质的zui常用溶剂。

 注意事项

 温度：一般采用低温（4℃以下）操作

 盐浓度：等渗盐溶液以0.02～0.05mol/L磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用；0.15mol/L氯化钠溶液应用也较多。

 pH：提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围

有机溶剂提取法

 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取；这些有机溶剂具有一定的亲水性，还有较强的亲脂性，是理想的脂蛋白提取液。

 必须在低温下操作。

 丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别*

 丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强。

 丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起酶

的变性失活。

 丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。

 表面活性剂的利用

 对于某些与脂质结合的蛋白质和酶，可以采用表面活性剂如胆酸盐及十二烷基磺酸

钠等处理。

 表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等）及非离子型（Triton X-100 、Tirton X-114、吐温60 及吐温80）等。非离子型表面活性剂比离子型温和，不易引起酶失活，使用较多。

 对提取物的保护

 无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使生物大分子降解，导致天然产物的量减少。

 二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用； 

 碘乙酸可以抑制活性中心有巯基的蛋白水解酶的活性

 苯甲磺酰氟化物（PMSF）能清除蛋白水解酶活力

 还可通过选择pH、温度或离子强度等，使反应条件适合于目的蛋白的提取。

 四、蛋白质的纯化

 做纯化前应做的工作： 

 了解目标物质的特性

 必须建立可靠的活性测定的方法 纯化流程 蛋白质的粗提纯 纯化 纯度鉴定

 活性测定

（一）蛋白质的粗提纯

 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。

 常用方法：盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀法

盐析法

 向蛋白质溶液中加入中性盐，在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析。

 由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

影响盐析的因素

 温度：一般室温操作，对温度敏感的蛋白可在低温下操作。

 pH：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度zui低。

 蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。

 盐析中常用的中性盐：硫酸铵

 盐析后除盐的方法：常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入透析袋内用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以在低温中进行；也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。

 等电点沉淀法

 蛋白质在表面静电荷为零状态时颗粒之间的静电斥力zui小，因而溶解度也zui小，利用各种蛋白质等电点的差别，可通过调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。

低温有机溶剂沉淀法

 有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低；有机溶剂与水作用能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。

 常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大。

（二）蛋白质粗品的纯化

 常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等。

 通常几种方法联合使用来获得较高纯度的蛋白质样品。

 凝胶过滤（分子筛） 

 是利用具有网状结构的凝胶作分离介质，根据被分离物质的分子大小不同对混合物进行分离的技术。

 层析柱中的填料是某些惰性的具有多孔网状结构的物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，小分子物质能进入其内部，流下来速度慢，而大分子物质却被排除在外部，流下来的速度快，当混合物通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同的分子量筛分开了。

凝胶过滤的优点

 所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷， 吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对待分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。

凝胶过滤的基本实验流程

 凝胶的选择 凝胶的预处理 装柱 层析柱的选择，填装的注意事项，平衡，使用前的检查 上样及洗脱 样品的预处理 凝胶柱的重复使用，凝胶的回收和保存

凝胶层析的应用

 脱盐 分离提纯 测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一种组分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。 高分子溶液的浓缩：SephadexG-25或G-50干胶。

离子交换层析

 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是以离子交换剂为固定相， 依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

 常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂。

 离子交换层析中，基质是由带电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换剂，带有负电荷的称之阳离子交换剂。

 当蛋白质处于不同的pH条件下时，其所带电荷的性质和数目都会不同。

 阴离子交换剂可以结合带负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。

 阳离子交换剂结合带正电荷的蛋白质，结合的蛋白也可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。离子交换层析的基本实验流程

 离子交换剂的选择和预处理 装柱 层析柱的选择，填装的注意事项，平衡 上样及洗脱 阶段洗脱 梯度洗脱 离子交换剂的再生和保存

 离子交换层析的应用

 在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。

 亲和层析

 在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗原与抗体的识别结合等，这种结合既是特异的，又是可逆的， 改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。

 将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中；那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开；然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件，将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。

亲和层析配基的选择

 某些生物分子可与层析载体相偶联制成亲和吸附剂，在一定条件下，这些分子能与

待分离的生物分子（如蛋白质）进行专一结合，在适当条件下又可重新解离，这些生物分子就叫配基。

 配基可以是较小的分子，如辅酶、辅基、变构酶的效应剂，也可以是大分子，如抗体、酶的抑制剂。

亲和层析中配基应具备的条件

 在一定条件下，能和待分离的生物大分子进行专一结合，且亲和力越大越好； 

 配基和生物大分子结合后，在一定条件下又能解离，且不能破坏生物大分子的生物活性； 

 配基上必须含有适当的化学基团，以便用化学方法将其偶联到载体上，偶联后不致影响配基和待分离物质的专一结合。

 在亲和层析中，配基选择是否合适是实验成败的关键。

 一般来说，根据待分离的生物大分子在溶液中与一些物质作用亲和力的大小和专一性进行选择。

 大多数情况下，理想的配基要做大量的实验进行筛选。

载体的选择

 一般为凝胶 理想的载体应具备的条件 不溶于水，但高度亲水；  惰性物质，非特异性吸附少 具有相当数量的化学基团可供活化；  理化性质稳定；  机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；  通透性好，为多孔的网状结构，使大分子

能自由通过。

常用载体

 琼脂糖凝胶亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附，极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，易于再生和反复使用。

 琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B 大，所以4B应用zui广。

 亲和吸附剂的制备

 载体的活化

 配基与活化载体偶联

 由于载体性质不同，活化及偶联的方法也有差异。

 亲和层析的基本实验流程

 吸附 使上柱样品和亲和吸附剂在柱内接触一定时间，保证两者之间充分起作用。 洗脱 改变pH、离子强度或缓冲液的组成 亲和吸附剂的再生

疏水层析

 它利用蛋白质表面有一部分疏水性， 与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。洗脱时将盐浓度逐渐降低，蛋白质因疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化。

 此法能分离其它一些方法不易纯化的蛋白质。 

（三）纯度鉴定

 蛋白质提纯以后需要有指标来说明它的纯度，从原则上看许多纯化蛋白质的方法也可以将它们改成纯度分析方法。

 由于蛋白质数量多，性质相似者在所难免，一个条件下两种蛋白质不能分开的可能性很大，一般均希望用两种以上的方法来分析蛋白质的纯度。只有一种检定方法时应该用两种以上条件来鉴定。

 对蛋白质纯度的要求因工作需要而异，生物制品考虑制品在体内的副作用，物理化学研究要求不干扰对象的物化性质，化学结构分析要示杂质含量低于分析方法的灵敏度等。

 确定蛋白质（或多肽）样品的纯度标准大致如下：分子大小是否均一，电荷是否均一，是否具有恒定的氨基酸组成，是否具有单一的N末端和C末端残基，进一步纯化时生物活性是否再有提高及能否结晶等。

 通常以电泳时呈现一条带以及末端残基鉴定是单一的即可进行顺序测定。

纯度鉴定的常用方法

 PAGE  SDS--PAGE  等点聚焦电泳 N--末端氨基酸分析 HPLC

（四）蛋白质含量测定

 总蛋白含量测定（mg/ml）：单位体积溶液中所含蛋白质的量。常用方法有Folin-酚

试剂法、Biored染色法等。 某一特定蛋白含量的测定（IU/ml）：单位体积溶液中所含的该种蛋白质活性单位数。根据蛋白质的自身特点进行定义，建立相应的检测方法。

 蛋白质的比活性（IU/mg）：单位质量蛋白质分子中所含的蛋白质活性单位数。

  活性测定贯穿于蛋白质提取和分离纯化的整个过程，通过活性分析和纯度鉴定跟踪目标蛋白，指导整个分离纯化工作。

五、蛋白质的浓缩、干燥和保存

（一）样品的浓缩

生物大分子在制备过程中由于过柱纯化使样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。

常用的浓缩方法

 减压浓缩：通过降低液面压力使液体沸点降低， 液体沸点降得愈低，蒸发愈快。此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。

 空气流动蒸发浓缩：将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不断蒸发，而达到浓缩目的。

 冰冻法：生物大分子溶液在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中。先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢融解，利用溶剂与溶质溶解点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。 

 吸收法：通过吸收剂直接吸收除去溶液中溶剂分子使之浓缩。吸收剂必须不与溶液起化学反应， 对生物大分子不吸附，易与溶液分开。聚乙二醇

 超滤法：使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，液体在一定压力下通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留。zui适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值等参数均不同， 必须根据工作需要来选用。

 （二）样品的干燥

生物大分子制备得到的产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，zui常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。

  真空干燥

在相同温度下，被干燥物质所含水分或溶剂由于周围空气压力的降低蒸发速度增加。真空度愈高，溶剂沸点愈低，蒸发愈快。其原理与真空浓缩（或称减压浓缩）相同。真空干燥适用于不耐高温、易氧化物质的干燥和保存。

  冷冻真空干燥

除利用真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同的压力下，水蒸气压随温度的下降而下降。在低温下低压下冰很容易升华为气体。将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。干燥后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。

 （三）保存

生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系，保存方法可分为干态和液态贮藏两种。但不论是干态或液态贮藏均应避免长期暴露于空气中以防微生物的污染。温度对生物大分子的稳定性影响很大，低温保存在大多数情况下是有利的。

 干态保存

 干燥的制品一般比较稳定，如制品含水量很低，在低温情况下物质大分子活性可在数月甚至数年无显著变化。

 方法：将干燥后的样品置于装有干燥剂的干燥器内密封，于0～4℃冰箱中保存即可。

 液态保存

 优点：免去干燥这一步骤，生物大分子的生理活性和结构破坏较少； 

 缺点：需要较严格的防腐措施，贮藏时间不能太长，如样品量大时封装运输不方便，实验室常采取少量安瓿封存法。

 液态贮藏注意事项如下： 

 样品不能太稀，必须浓缩至一定浓度后才能封装贮

藏，样品太稀时易引起生物大分子变性作用。

 一般需加入防腐剂和稳定剂。蛋白质和酶常用的稳定

剂有蔗糖、甘油等，酶也可加入底物和辅酶以提高其

稳定性。

 贮藏温度要求较低。大多数在0℃左右冰箱保存即可， 

有的则要求更低温度。