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微生物金属蛋白酶的研究进展

来源:上海高创化学科技有限公司   2012年02月23日 10:26  

金属蛋白酶Metalloproteinase)是活性中心依赖于金属离子的一类蛋白酶。大多数金属蛋白酶是 Zn2+金属蛋白酶,依据Zn2+的结合位点可将金属蛋白酶分为五类。金属蛋白酶分布广泛,性质特异,具有重要的经济和应用价值。目前主要应用于食品、洗涤剂、化妆品及抗肿瘤等药物和疾病的机理研究等方面。目前由于金属蛋白酶来源有限,限制了金属蛋白酶的进一步发展,所以研究微生物金属蛋白酶,利用微生物发酵大规模工业化生产金属蛋白酶具有很大的现实意义。国内关于微生物金属蛋白酶的报道很少,本文就微生物金属蛋白酶的研究情况作一综述。

  1 金属蛋白酶的特点和分布

  除具有蛋白酶的一般特点外,金属蛋白酶zui大的特点就是活性中心依赖于某种金属离子,能够被金属资合剂强烈抑制。由于来源不同,金属蛋白酶大多具有自身与众不同的特点,因此具有广泛的应用。已经报道从海洋细菌中得到一些性质特异的金属蛋白酶,它们具有嗜低温或耐高温、耐有机溶剂、热敏感、耐碱等性质,这些特性是食品工业和日用化工等领域所迫切需要的,有着很大的应用潜力。基质金属蛋白酶(MMPs)家族是机体内重要的一类蛋白酶家族,目前共发现十七个,这类酶具有一些共性:a.均以酶原的形式分泌出来,b.活性都依赖 Zn2+存在,c.结构上具有40%-50%的同源性,d.均能被金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)所抑制,e.均能降解一种或多种细胞外基质成分。MMPs调控失衡与关节炎、多发性硬化症及恶性肿瘤的生长和转移等的多种疾病密切相关,因此详尽地研究其结构对于药物筛选和疾病治疗有重大意义。
  金属蛋白酶种类多、分布广。基质金属蛋白酶家族广泛存在于机体中。唤蛇科和挂蛇科毒蛇蛇毒中的出血毒素也是金属蛋白酶,目前已发现110多种蛇毒金属蛋白酶,它们大多数都是含锌金属蛋白酶。对它们的研究将为治疗蛇伤药物的筛选提供理论依据。同时,金属蛋白酶在微生物类群中也广有分布,很多微生物属中都有产金属蛋白酶的报道,近几年来有不少关于海洋细菌产金属蛋白酶的报道。

  2 微生物金属蛋白酶的结构

  大多数金属蛋白酶是含Zn2+的蛋白,Zn2+是很多与新陈代谢密切相关的蛋白的整合组分。对许多含m2+蛋白的x一射线晶体学分析已经确定了催化性Zn2+和结构性Zn2+的特征;在所有已知晶体结构的Zn2+酶中,催化性Zn2+与三个氨基酸残基和一个活性水分子配对,而结构性Zn2+则与四个Cys残基配对。HisGIuAspCys残基的组合组成一个三齿形的活性Zn2+位点,再加上一个活性水分子组成配位区。对金属离子依赖性酶间的结构活性关系的研究有利于我们为不同目的而设计各种工程金属蛋白酶。将金属蛋白酶的结合位点引人蛋白质,不仅能够调节酶的活性,而且能够诱发特异的可预测的构象变化。计算机分析有助于在酶的三维结构中确定可引入金属离子结合位点的合适位置。
  已被详尽研究的金属蛋白酶可作为其它蛋白结构的参照标准,初级结构的相似性被用于这些蛋白的分类。zui近的一篇综述将所有的金属内肽酶依据序列对比分为五类。细菌产的金属蛋白酶经X- 射线晶体学分析的含Zn2+Ca2+稳定性的中性金属内肽酶有嗜热解蛋白芽孢杆菌(Bacillus thermopro teolyticus)产的嗜热菌蛋白酶;蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)产的中性蛋白酶;铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)产的弹性蛋白酶。这三种酶的结构被用作与其它没有X-射线晶体学标准的金属蛋白酶进行分析比较的参照。
  近几年来,关于Zn2+金属蛋白酶的序列信息得到的越来越多。金属蛋白酶家族的*个"共有序列"是通过对人类成纤维细胞胶原蛋白酶和沙雷氏菌蛋白酶Zn2+结合位点侧面的11个氨基酸之间的同源性比较得出的。zui近,在许多含Zn2+蛋白酶中都发现了序列HEXXH,包括一些真核的Zn2+蛋白酶,可以以此确定各蛋白酶之间的关系。

  3 微生物来源的金属蛋白酶及性质

  细菌不少属中都有产金属蛋白酶的菌株,如假单胞菌属(Pseudomonas)、弧菌属(Vibrio)、变形杆菌属(Proteus)、欧文氏菌属(Erwinia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Es cherichia)、交替单胞菌属(Alteromonas)和沙雷氏菌属(Serratia)等中都有产金属蛋白酶菌株的报道。真菌和放线菌所产金属蛋白酶也有少量报道。
  对耐热蛋白酶的研究曾经是微生物金属蛋白酶研究的一个主要方面。1970HMatsubara等从嗜热解蛋白芽孢杆菌(Bacillus thermoproteoluticus)中得到嗜热菌蛋白酶,该酶具有较高的耐热性,在温度达80条件下仍具有很高的稳定性。Murao等(1991)从一株嗜热微菌属中得到一耐热金属蛋白酶,zui适作用温度为751997Sako等得到一超稳定性的胞外金属蛋白酶,zui适作用温度为100,在1mM CaCl2
的条件下竟可达110℃,是当时报道过的zui耐热的胞外蛋白酶,达到了耐热金属蛋白酶研究的新高度。九十年代中期开始,随着对海洋微生物蛋白酶的进一步开发,人们对微生物金属蛋白酶的研究重点逐渐向嗜冷酶、抗有机溶剂、耐碱性环境等方面转移。很多有关报道的金属蛋白酶是由海洋细菌产生的。*个嗜冷菌是由JFor ster 1887年报道的,而嗜冷菌大多产生嗜冷酶。 1995Kohei等从海洋弧菌T1800中提取到一新的金属蛋白酶Vimelysin,该酶在低温和有机溶剂条件下仍具有高活力,以干酪素为底物zui适作用温度为50℃,而以FAGLA为底物时的zui适作用温度为 15℃,另外值得一提的是,在25℃50%乙醇的条件下48小时该酶仍能保留全部活力,是一种性质*的蛋白酶。Masahiro等(1997)同样从海洋交替单胞菌No.3696发酵产物中分离纯化到一新的金属蛋白酶,该酶也是嗜冷酶。耐碱性条件的蛋白酶也有不少报道。1991David等从鳗弧菌(Vibrio an guillarum)中得到两种金属蛋白酶,对其中一种进行了性质研究,表明该酶具有较广的pH稳定性(6.0 10.0),在pH10.0具有zui高活性。1997Kazumasa 等也从一株弧菌中获得两种新的胞外蛋白酶,对其性质研究表明它们都属碱性金属蛋白酶,在 pH9.510.0间具有很高活性,CaCl2能显著增加pH 的稳定性,使其在pH6.011.0广范围内活性稳定。本实验室从海洋鱼肠道内得到一株假单胞菌,所产的金属蛋白酶为嗜冷酶,zui适作用温度为45℃,耐碱性条件,zui适作用pH10.0,在nH7.011.0广范围内活性稳定,对有机溶剂具有很强的耐性。
  金属蛋白酶除具有蛋白酶的一般的性质外,还具有自身的特性。研究表明其活性中心都依赖于某种金属离子,都被金属离于资合剂(EDTAEGTA NaCN或邻二氮来菲等)强烈抑制;但所依赖的金属离子过量也可抑制酶的活性;被金属离子螫合剂失活后,能使其活性恢复的金属离子并不一定是其活性中心依赖的金属离子。Keun Ⅱ等(1995)对大肠杆菌中的一种细胞质金属内肽酶分离提纯,研究表明该酶经NaCN0.2mM)失活后,Mn
2+Co2+ Cu2+能使酶活性部分恢复,而Zn2+Ca2+Mg2+则不能;若不经过NaCN失活,Zn2+Co2+Cu2+强烈抑制酶活,而Mg2+Ca2+Mn2+有激活作用。推份 Co2+可能是该酶的辅助因子。但经HRICP质谱分析zui终确定该酶却是Zn2+依赖性金属蛋白酶。因此,确定某金属蛋白酶依赖何种金属离子必须通过 HR-ICP质谱分析等手段来确定,而仅仅依靠金属离子对酶性质的影响来判断还是不够的。
  来源不同的微生物金属蛋白酶,其性质方面在很大差异。几种已报道的微生物金属蛋白酶的性及总结如表1

1 微生物金属蛋白酶

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产酸菌体                研究者     MwKDa PI   zui适pH    zui适T       文献

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Alteromonas spNo.3696 Masahiro S   28     4.3  7.58.0  40℃        [27]

Vibiro sp.T1800         Kohei O      38     4.3  8.0/6.5   50℃/15℃   [22]

Vibiro sp NUFBPP1     Kazumasa F   48          9.510.0 55℃        [20]

Vibiro sp NUFBPP1     Kazumasa F   36          9.510.0 55℃        [20]

Pseudomonas fluorescens Kim H J      4647      5.5                   [17]

Aeropyrum pernix K1     SakoY        52          5.09.0  100℃/110℃ [30]

Thermomicrobium sp      Murao S      35          8.5       75℃        [29]

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  4 微生物金属蛋白酶的应用

  由上述可以看出,微生物金属蛋白酶有许多很具利用潜力的特异性质,在很多行业领域都具有广泛的用途。
  食品业:蛋白酶是食品工业中应用zui广泛的酶,能够提高食品的品质、稳定性、可溶性等。微生物金属蛋白酶应用于食品业具有以下优点:(1)来自于微生物,可实现微生物工业化生产,提供廉价、充足的酶源。(2)一般不含有毒物质。(3)在温和条件下发生作用,需酶少,副反应少。(4)反应完成后,酶容易灭活。本实验室所得的金属蛋白酶在45℃具有zui高活性,但50℃30分钟就能使全部失活,不影响食品风味,具有很大的经济价值和开发潜力。
  日用化工:微生物金属蛋白酶在日用化工方面的应用,主要是用于洗涤业和化妆品的生产与开发。蛋白酶是洗涤剂常用的添加剂,用于洗涤业的蛋白酶要求在低温条件下具有高活性、抗有机溶剂、耐碱性环境等。很多已报道的微生物金属蛋白酶具有以上特性,前面提到的Kohei等得到的Vimelysin 就是一种很合适的蛋白酶,具有*的耐有机溶剂能力,而且很低温度下具有高活性。微生物金属蛋白酶在化妆品方面,主要作用是能够促进老化角质层的除去;增强洗净效果;溶解角栓,防治粉刺的形成。化妆品一般要选择来源于微生物和植物,能耐热,zui适pH值接近中性的酶。另外,据报道皮肤细胞中的金属蛋白酶mRNA的水平还是一项评估化妆品效果试验的重要参数。
  医药:微生物金属蛋白酶在医学上的应用,多是利用它们对病理条件下产生的蛋白的分解能力。粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)产生一种金属蛋白酶 SMP,这种酶在医疗上被用作消炎药。多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)可产生一种在医疗上很有利用价值的中性金属蛋白酶,特别是在皮肤病学上,因为它能特异地降解纤连蛋白和型胶原蛋白。
  他:鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是鲑类鱼类弧菌病的病原菌,可引起暴发性败血病和迅速组织坏死,给海洋养殖造成重大经济损失。研究表明,该菌产生的金属蛋白酶是这类疾病的重要致病因素,对该酶的研究将有助于对该病发病机理和防治的研究。

  5 微生物金属蛋白酶的发展前景

  金属蛋白酶具有很高的经济价值,有着广泛的应用。微生物可以提供成本低、质量高、来源丰富的酶源。近几年来,对于极瑞环境中的具有*性质(如耐低温、耐有机溶剂、耐碱等)的金属蛋白酶研究居多。筛选不同特异环境中分泌金属蛋白酶的高产菌株,获得性质特异的金属蛋白酶;通过基因工程和蛋白质工程手段来进一步提高酶的产量及活性;通过分子生物学技术将高等生物的产金属蛋白酶基因转入细菌中表达,都具有非常广阔的发展前景。金属蛋白酶在食品、化工、医药等方面将迎来一个全新的发展阶段。

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