High Performance Liquid Chromatography

 Analysis  of  Saccharides

HPLC 糖类的分析

1. 简介

糖，包括食糖，是自然界广泛生成的一类有机化合物，是我们身体的主要能源、人体组成的要素，同时也是参与多种生理功能的重要物质，在我们人体中起着非常巨大的作用。因此，糖类的分析是生理学领域中的基本部分。糖类分析zui通用的方法是液相色谱法(HPLC)。本文将介绍HPLC分析糖类主要的分离和检测方法。

2. 糖类的分析方法

糖类的种类繁多，分子量从180的单糖(例如葡萄糖)到几百上千一直到几百万的淀粉。单糖又被分为中性糖(如葡萄糖)、氨基糖(如氨基葡糖)、糖醛酸(如葡糖醛酸)和糖醇(如山梨醇)。另外，每种糖都有许多异构体。

因此，用HPLC分析糖一定要有效地应用的分离和检测方法，还要考虑样品化合物的浓度和类型。表1列出了HPLC糖分析的分离及检测的方法。

表1 分离和检测

                     凝胶色谱法

      分离           正相色谱法

                     配位体交换色谱法

                     阴离子交换 色谱法

                     紫外吸收检测

      检测           示差折光检测

                     衍生(化学反应检测)

3. 糖的HPLC分离方法

3.1 凝胶色谱法

凝胶色谱法是基于糖分子的大小进行分离的方法。按照惯例我们可以使用右旋糖酐(dextran)和聚丙烯酰胺(polyacrylamide)凝胶作为柱填料，但是这些凝胶的缺点是不耐高压，现在zui通用的填料是新开发的可耐高压的聚苯乙烯磺酸钠和聚甲基丙烯酸酯甘油(glyceryl polymethacrylate)凝胶。

图1 显示的是几种不同孔径凝胶色谱柱分析聚乙二醇的校正曲线。

图2 是用经过选择适合样品的分子量

范围的孔径的凝胶色谱柱分析葡聚糖的洗

脱图。

条件：

色谱柱： 500mmx8.0mm i.d.

流动相： 水

流速：   1.0ml/min

温度：   25 ℃

检测器： 示差折光检测器

峰：

  1.dextran MW500K,  2.dextran MW250K,  3.dextran MW150K,  4.dextran MW70K,

  5.dextran MW20K,    6.dextran MW10K,    7. 1,2-亚乙基二醇(HOCH2CH2OH)

值得注意的是用聚苯乙烯磺酸钠凝胶色谱柱分析酸性的糖时，由于离子的排斥作用，洗脱非常快，而分析基本糖类时，由于离子的相互作用，洗脱的要慢的多。

3.2 正相色谱法

正相色谱法分析从单糖到低聚糖非常有效，它甚至可以把低聚糖分离成单一组份以便定性。过去，正相色谱法分析糖时，用磺酸盐型阴离子交换树脂或锂和铵盐的正离子交换树脂作填料，用乙醇/水作流动相，但不幸的是，分析通常要耗时一小时以上。现在，用硅胶固定相和氨丙基(aminopropyl)化学结合作柱填料，乙腈(acetonitrile)和水作流动相，糖在色谱柱中的保留取决于糖的划分。

图3 是糖标准品的色谱图

条件：

色谱柱：Shim-pack CLC-NH2

        氨基柱(150mm X 6.0mm i.d.)

流动相：乙腈/水=7/3(V/V)

流  速：1.0mL/min

温  度：25℃

检测器：示差折光检测器

色谱峰：

1：丙三醇(glycerol)，2：木糖(xylose)，3：阿拉伯糖(arabinnose)，4：果糖(fructose)，

5：葡萄糖(glucose)，6：半乳糖(galactose)，7：蔗糖(sucrose)，8：麦芽糖(maltose)，

9：异麦芽糖(isomaltose)，10：麦芽三糖(maltotriose)

图4 是同上色谱条件糖类的保留时间

1：溶剂，2：鼠李糖(rhamnose)，3：木糖(xylose)，4：来苏糖(lyxose)，5：岩藻糖(fucose)，

6：阿拉伯糖(arabinose)，7：山梨糖(sorbose)，8：果糖(fructose)，9：甘露糖(mannose)，

10：葡萄糖(glucose)，11：山梨醇(sorbitol)，12：甘露糖醇(mannitol)，13：半乳糖(galactose)，

14：蔗糖(sucrose)，15：纤维素二糖(cellobiose)，16：麦芽糖(maltose)，17：麦芽糖醇(maltitol)，

18：肌醇(inositol)，19：海藻糖(trehalose)，20：异麦芽糖(isomaltose)，21：乳糖(lactose)，

22：蜜二糖(melibiose)，23：麦芽三糖(maltotriose)，24：蜜三糖(raffinose)，

25：麦芽四糖(maltotetraose)，26：麦芽五糖(maltopentaose)

正相色谱法可以分离二糖酶(disaccharides)，这对于体积排除法和配位体交换法很困难。正相色谱法分析中，通过调整乙腈和水的比率可以控制糖的分离及保留时间，增大水的浓度，可以加快糖的洗脱，并使大分子量的糖加快到合理的时间洗脱出来。

图5 是葡萄糖及其低聚物(二聚物(dimer)到

     六聚物(hexamer))的色谱图

条件：

色谱柱：Shim-pack CLC-NH2

        氨基柱(150mm X 6.0mm i.d.)

流动相：乙腈/水=6/4(V/V)

流  速：1.2mL/min

温  度：25℃

检测器：示差折光检测器

色谱峰：

1：葡萄糖， 2：麦芽糖， 3：麦芽三糖(maltotriose)，4：麦芽四糖(maltotetraose)，

5：麦芽五糖(maltopentaose)，6：麦芽六糖(maltohexaose)

在此分析中，水的浓度增加到了40%，进一步增加水的浓度，可以分离含有10至15个葡萄糖分子的化合物。相反，降低水的浓度，可以改善单聚物(monomer)的分离，但是，如果浓度低于20%，由于溶解度的降低，有时会出现不对称峰。作为流动相，乙基乙酸丙酮(acetone-ethyl acetate)/水也可以用于糖类的分析，它的特点是毒性比乙腈/水低。近来，树脂(不是硅胶)色谱柱在正相色谱法中越来越流行，由于填料不易水解(hydrolyze)，所以树脂色谱柱更耐用。也有些学者提出用十八烷基(octadecyl)和硅或硅胶化学结合作色谱柱，乙腈/水加胺(amine)作流动相来分析糖类。

3.3 配位体交换色谱法

用聚苯乙烯磺酸钠凝胶(sodium sulfonated polystyrene gel)色谱柱无法分离相同分子量的二聚糖和更高分子量的糖，但是，它可以分离一些相同分子量的单糖，象葡萄糖和果糖。配位体交换色谱法是又一种HPLC分析糖的方法，通过选择Ca+、Na+、Pb+ 等相对离子(counter-ion)，可以改变单糖的选择性，从而改善它们的分离。此种方法有一个广为人知的优点，就是只用水作流动相，分析简单，因此，近来一系列各式各样相对离子的色谱柱已经得到了广泛的商业应用。

在分析过程中，糖主要通过与金属性的相对离子结合而被保留，保留时间取决于它们和金属性相对离子的水合分子相互作用所产生的结合物的稳定性。图6、图7和图8分别提供了含有Na、Ca、Pb的聚苯乙烯磺酸盐硅胶色谱柱分析糖所得到的色谱图。

图6.使用Na型柱Shim-pack SCR-101N

条件：

色谱柱：Shim-pack SCR-101N

        (300mm x 7.9mm i.d.)

流动相：水

温  度：60℃

流  速：0.6mL/min

色谱峰：

1：葡聚糖MW10K(dextran MW10K)，2：蔗糖，3：葡萄糖，4：果糖，5：酒精(ethanol)

图7.使用Ca型柱Shim-pack SCR-101C

条件：

色谱柱：Shim-pack SCR-101C

        (300mm x 7.9mm i.d.)

流动相：水

温  度：80℃

流  速：1.0mL/min

色谱峰：

1：葡聚糖MW10K(dextran MW10K)，2：麦芽三糖，

3：麦芽糖，4：葡萄糖，5：果糖，

6：丙三醇(glycerol)，7：酒精，8：山梨醇(sorbitol)

图8.使用Pb型柱Shim-pack SCR-101P

条件：

色谱柱：Shim-pack SCR-101P

        (300mm x 7.9mm i.d.)

流动相：水

温  度：80℃

流  速：0.6mL/min

色谱峰：

1：蔗糖，2：葡萄糖，3：木糖(xylose)，

4：半乳糖(galactose)，5：阿拉伯糖，6：果糖，

7：丙三醇(glycerol)，8：甘露糖醇(mannitol)，9：核糖(ribose)，10：山梨醇(sorbitol)

图9.列出了糖的保留时间，Ca柱分离单糖的效果比Na柱好，而Pb柱得到更好的分离效果；Ca柱和Pb柱对糖醇的保留长一些，可以分离葡萄糖和山梨醇，这对于Na柱是作不到的。在配位体交换色谱法分析中，色谱柱要保持较高的温度，图10 表示色谱图随温度变化的关系。当色谱柱保持室温时，葡萄糖，一种还原糖，分成了两个峰，这是端基异构体(anomer)造成的，随着温度的增加，变旋作用的速度也随之增强，两个峰逐渐合为一个峰。另一方面，羟基(OH- )对变旋作用起着催化剂的作用，在流动相中加入象三乙胺(triethylamine)这样的化合物，和升高柱温的效果是相同的，在这种情况下，色谱柱要换成Ca柱。

图9.Shim-pack SCR分析糖的洗脱时间

1：蜜三糖，2：麦芽三糖，3：蔗糖，4：麦芽糖，5：乳糖，6：葡萄糖，7：甘露糖醇，

8：鼠李糖，9：山梨醇，10：半乳糖，11：甘露糖，12：木糖，13：果糖，14：肌醇，

15：木糖醇，16：岩藻糖，17：阿拉伯糖，18：丙三醇，19：核糖，20：乙醇

图10.温度对分离的影响

条件：

色谱柱： Shim-pack SCR-101C (300mm x 7.9mm i.d.)

流动相：水              流速：0.8mL/min

色谱峰：1：蔗糖，2：葡萄糖，3：山梨醇

3.4 阴离子交换色谱法

糖的羟基团呈弱酸性，分裂常数也很低，约为10-12。因此，在阴离子交换色谱法分析糖时，流动相的PH值要大于12，并且HPLC系统也要经受同样的条件。然而，还有另外一种交换的方法，就是由于象糖类这样的聚羟基(polyhydroxy)化合物可以和硼酸(boric acid)反应产生带负电荷的联合体(如图11)，因此，用硼酸缓冲溶液作流动相，通过糖和硼酸反应，可以进行糖的分析。

图11： 

图12.是一个用Shim-pack ISA-07色谱柱得到的典型的阴离子交换法分析糖的色谱图。糖/硼酸联合体阴离子交换对二聚糖和单糖的*分离非常有效，它提供的分离度远远好于其它方法，不幸的是，不同组份的保留时间差别很大，二聚糖和单糖的分离要耗费很长时间，色谱峰也比较宽，在同等条件下，不可能有高的分析效率。目前，分析中通常使用梯度模式，硼酸缓冲溶液和流动相的PH值随时间的变化而变化，因此，也需要恰当的检测方法与之相适应。

图12.用Shim-pack ISA-07色谱柱得到的典型的阴离子交换法分析糖的色谱图

条件：

色谱柱：Shim-pack ISA-07

        (250mm x 4.0mm i.d.)

流动相：300mM(钾potassium)

        硼酸盐(borate)缓冲液

流  速：0.6mL/min

温  度：65℃

检  测：精氨酸(arginine)柱后衍生 荧光 Ex:320nm, Em:430nm

色谱峰：

1：甘露糖，2：果糖，3：半乳糖，4：木糖，5：葡萄糖

4. 糖的检测方法

4.1 吸收检测法

紫外( ultraviolet )吸收分光光谱法是HPLCzui通用的检测方法， 可是由于糖的吸收波长较短(约在190nm)， 在此波长下， 流动相和杂质的影响较大，所以它不太适用于糖类的分析。但糖醛酸(uronic)和唾液酸(sialic acid)的吸收波长约在200至210nm，因而可以用这种方法检测。图13为血清酸性水解物中唾液酸的色谱图。

条件：

色谱柱：Shim-pack SCR-101H

        (300mm x 7.9mm i.d.)

流动相：10mM磷酸水溶液

流  速：1.5mL/min

温  度：55℃

检测器：205nm

4.2 示差折光检测法

示差折光检测器目前广泛地应用于HPLC糖的检测，高灵敏度、稳定的示差折光检测器的利用，可以使我们检测到低于100ng的糖，图14是高灵敏度HPLC检测糖的谱图。尽管经常使用这种检测器分析糖，但当我们作痕量分析特别象生化样品这样杂质较多的样品时，往往得不到令人满意的结果。还有一个不足之处，就是它不能用于梯度洗脱，这就意味着它不能用于硼酸缓冲溶液的阴离子交换法(见第3.4节)，影响多组份样品的分析。

图14 示差折光检测器测糖

条件：

色谱柱：Shim-pack SCR-101N

        (300mm x 7.9mm i.d.)

流动相：水

流速：  1.0mL/min

温度：  50℃

检测器：示差折光检测器

色谱峰：

1.蔗糖，2.葡萄糖，3.果糖，各200ng

4.3 衍生(化学反应检测法)

在液相色谱法中，经常通过选择适当的试剂与样品衍生，使之在紫外或可见波段产生吸收，或产生荧光，以增强检测的灵敏度和选择性。这种方法在需要准确无误地检测出混合样品中痕量化合物的生化领域特别有效。许多衍生的方法已经被开发出来，并被广泛地应用。

衍生法在HPLC分析糖时也非常有效，又分为柱前衍生和柱后衍生。

4.3.1 柱前衍生法

在柱前衍生法中，由于目标化合物优先在进入分析柱之前衍生，因此试剂、反应时间、反应温度等条件，比起柱后衍生法来说，可以在较宽的范围内选择，即使反应试剂被检测出来，只要把它和目标化合物分离，也不会产生问题，但样品的前处理要简单而快速。对于柱前衍生法分析糖，用肼(dansylhydrazine)和 2-氨基嘧啶(2-aminopyridine)作试剂，酯化作用法和荧光衍生法均非常有效。在糖蛋白寡糖链的分析中，2-氨基嘧啶作试剂有着特殊的效果。

4.3.2 柱后衍生法

在柱后衍生法中，目标化合物在分离后被衍生。这种方法有几个条件必须被满足：由于衍生试剂是连续地被加入到流动相中，因此它不能被检出；为保证良好的峰形，反应时间要尽可能的缩短；zui后，为使系统设计简练和操作简单，试剂的数量要尽可能少。尽管有这些要求，柱后衍生法还是有许多引人注目的优点，它有良好的重现性和线性，更适合于自动分析。

图15是岛津公司糖分析系统(梯度洗脱系统)的流路图，该系统采用柱后荧光衍生法，精氨酸(arginine)作衍生试剂。

图中装置分别为：

1：泵，2：流动相，3：进样器，4：色谱柱

5：柱箱，6：泵，  7：试剂， 8：反应器

9：反应室，10：荧光检测器，

11：数据处理机，12：阻尼器，13：废液

总之，正相色谱法、凝胶色谱法、配位体交换色谱法都可以分析糖类，但用硼酸缓冲溶液的阴离子交换色谱法可以得到*的效果。图16是一个高灵敏度分析的实例，图17是梯度洗脱系统的实例。另外，电化学检测器也可以用于糖的分析。

图16.    条件：

色谱柱：Shim-pack ISA-07

        (250mm x4.0mm i.d.)

流  速：0.6mL/min

温  度：65℃

流动相：300mM(钾potassium)硼酸盐缓冲液

检  测：精氨酸柱后衍生法，荧光：Ex320nm，Em430nm

色谱峰：

1：蔗糖，2：麦芽糖，3：鼠李糖，4：甘露糖，5：果糖，6：半乳糖，7：木糖，8：葡萄糖

除蔗糖为 1nmol 外，其余均为 100pmol.

图17     条件：

色谱柱：Shim-pack ISA-07

        (250mm x4.0mm i.d.)

流  速：0.6mL/min

温  度：65℃

流动相：A：100mM(钾potassium)硼酸盐缓冲液

        B：400mM(钾potassium)硼酸盐缓冲液

        梯度： from A to B 50min

检  测：精氨酸柱后衍生法，荧光：Ex320nm，Em430nm

色谱峰：

1：蔗糖，2：纤维二糖(cellobiose)，3：麦芽糖，4：(loctose)，5：鼠李糖，6：核糖，

7：甘露糖，8：阿拉伯糖，9：半乳糖，10：异麦芽糖，11：木糖，12：葡萄糖