观察与免疫相关的几种细胞的形态，了解它们在机体免疫反应中的作用。

显微镜

血液涂片（瑞氏染色）

结缔组织切片

油镜观察

（A）    红细胞：淡红色，无核的圆形细胞，因红血球为双凹形，故边缘部分染色较深，中心较浅，直径7—8微米。

（B）    颗粒白血球

嗜中性颗粒白血球：体积略大于红细胞，细胞核被染成紫色分叶状，可分1—5叶，核叶之间联以染色质细丝，染色质染成粉色，其中充满细小的大小均匀的颗粒被染成紫红色。直径10—12微米。

嗜酸性颗粒白血球：略大于嗜中白血球，细胞核染成紫色，通常为2叶，胞质充满嗜酸性大圆颗粒，被染成鲜红色。直径10—15微米。

嗜碱性颗粒白血球：体积略小于嗜酸性白血球，细胞质中有大小不等被染成紫色颗粒，颗粒数目较嗜酸性白血球的颗粒少，核为1—2叶染成淡兰色。直径10—11微米。

（C）    无颗粒白血球

淋巴细胞：涂片中可观察到中、小型两种。小淋巴细胞与红血球大小相似，圆形。其中含致密的核，染成深紫色。周围仅有一薄层嗜硷性染成淡蓝的细胞质。中淋巴细胞较大，有较宽层的细胞，核圆形。6-8微米。

单核细胞：体积zui大，细胞圆形。胞质染成灰蓝色。核呈肾形或马蹄形，染色略浅于淋巴细胞的核。直径14-20微米。

胞体较大，呈卵圆形，胞质内充满粗大均等的嗜硷性颗粒。其中含肝素、组织胺等物质。常成群地分布于血管的周围。

三．浆细胞的观察（示教）

细胞呈圆形或卵圆形，胞质丰富，呈嗜硷性。核圆形，着色深，多偏于细胞的一侧，染色质核膜呈车轮分布。正常组织浆细胞少，慢性炎症时增多。浆细胞合成和分泌抗体，对免疫有重要意义。

四．巨噬细胞：又称组织细胞，细胞形态不规则。常伸出短而钝突起，有很强的吞噬能力。

瑞特氏染色：

1．染色液配置

称取瑞特氏染料0.1克溶于60ml甲醇中，过滤。贮褐色瓶中备用。（配置时，要先将瑞特氏染料置研钵体内边研边滴加甲醇，使染料溶液得更好。）

2．瑞特氏染色法：

取小鼠骨动脉血，涂制玻片。干后用玻璃笔在涂处之两侧划线（限制染液流掉）。于划线内部滴加染液3-4滴，经3-5分钟后，再滴加等量的蒸馏水，轻轻晃动混合。经5分钟后，用蒸馏水洗净，待干后用油镜检查。

 

可溶性抗原与相应的抗体混合，在电解质存在的条件下，两者比例适合，即可有沉淀物出现，叫沉淀反应（Precipitation）.由于沉淀反应抗原多系胶体溶液。沉淀物主要是由抗体蛋白所组成。

为了求得抗原与抗体的适宜比例，保证有足够的抗体，而且抗原分子小，具有较大的反应面积，因此操作上通常是稀释抗原，不稀释抗体。

沉淀反应的种类有环状沉淀、絮状沉淀、荚膜膨胀、琼脂扩散及免疫电泳等。此外还有放射性同位素标记、酶标记等测定法。

当抗原与相应抗体形成一个接触面时，如二者比例适当，接触面上可形成一个乳白色的环状物即为阳性沉淀反应。

1.         免疫血清：免疫兔抗人血清

2.         抗原：人血清

3.         小沉淀管、毛细吸管、橡皮头、生理盐水。

1.         取小沉淀管2只，以毛细吸管吸取抗人血清约0.2毫升，加入*管，加时注意不能有气泡。

2.         以毛细吸管吸取生理盐水0.2毫升加入第二管。

3.         用毛细吸管吸入血稀释0.2毫升加入各管，加时应注意使抗原溶液缓缓由管壁流下，轻浮于血清面上，使成一明显界面，切勿使之相混。

4.         置室温中10—20分钟，观察液面有无乳白色沉淀环，若有则为阳性。

 

琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀反应。

抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇时，便出现可见的白色沉淀线。这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时，便依各自扩散速度的差异，在适当部位形成独立的沉淀线，因此广泛地用于抗原成分的分析。琼脂扩散试验可根据抗原抗体反应的方式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免疫电泳、对流免疫电泳、单向及双向火箭电泳试验。

1．诊断血清（抗体：抗人IgG或IgA免疫血清）

2．待检血清（抗原）：人血清

3．参考血清：全国统一人血清免疫球蛋白参考血清（批号不同，免疫球蛋白含量不同）。

4．其它：生理盐水、琼脂粉、微量进样器、打孔器、玻璃板、湿盒等。

方法：

1．将适当稀释（事先滴定）的诊断血清与予溶化的2%琼脂在60℃水浴预热数分钟后等量混合均匀制成免疫琼脂板。

2．在免疫琼脂板上按一定距离（1.2—1.5厘米）打孔，见图1。

 

3．向孔内滴加1：2，1：4，1：8，1：16，1：32稀释的参考血清及1：10稀释的待检血清，每孔10微升，此时加入的抗原液面应与琼脂板一平，不得外溢。

4．已经加样的免疫琼脂板置湿盒中37℃温箱扩散24小时。

5．测定各孔形成的沉淀环直径（mm）,用参考血清各稀释度测定值绘出标准曲线，再由标准曲线查出被检血清中免疫球蛋白的含量。

材料：

1．诊断血清：兔抗人血清

2．待测血清：人血清

3．阴性对照血清

4．其它：生理盐水、琼脂粉、载玻片、打孔器、微量进样器等。

1．取一清洁载玻片，倾注3.5—4.0毫升加热熔化的1%食盐琼脂制成琼脂板。

2．凝固后，用直径3毫米打孔器，孔间距为5毫米。孔的排列方式如图2所示。

3．用微量进样器于*孔加抗体，于周围孔加各种抗原。加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。

4．加样后的琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24—48小时。

5．结果观察：若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原—抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。若在72小时仍未出现沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出现阳性对照与被检样品的沉淀线发生融合，才能确定待检样品为真正阳性。

6．结果分析：琼脂扩散结果受许多因素影响。

①抗原特异性与沉淀线形状的关系：在相邻两*相同的抗原与抗体反应时，则可出现两单沉淀线的融合。反之，如相邻抗原*不同时，则出现沉淀线之交叉；两种抗原部分相同时，则出现沉淀线的部分融合。见图3。

②抗原浓度与沉淀先导形状的关系：两相邻抗原浓度相同，形成对称相融合的沉淀线；如果两抗原浓度不同，则沉淀线不对称，移向低浓度的一边。见图4。

 

③温度对沉淀线的影响：在一定范围内，温度扩散快。通常反应在0-37℃下进行。在双向扩散时，为了减少沉淀线变形并保持其清晰度，可在37℃下形成沉淀线，然后置于室温或冰箱（4℃）中为佳。

④琼脂浓度对沉淀线形成速度的影响：一般来说，琼脂浓度越大，沉淀线出现越慢。

⑤参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线形成的影响：抗原、抗体相距越远，沉淀线形成的越慢，所以在微量玻片法时，孔间距离以0.25-0.5cm为好，距离远影响反应速度。当然孔距过远，沉淀线的密度过大，容易发生融合，有碍对沉淀线数目的确定。

⑥时间对沉淀线的影响：沉淀线形成一般在1-3天出现，14-21天出现的数目zui多。玻片法可在1-2小时出现，一般观察72小时，放量过久可出现沉淀线重合消失。

       对流免疫电泳是在琼脂扩散基础上结合电泳技术而建立的一种简便而快速的方法。此方法能在短时间内出现结果，故可用于快速诊断，敏感性比双向扩散技术高10-15倍。

血清蛋白在PH8.6条件下带负电荷，所以在电场作用下都向E极移动。但由于抗体分子在这样的PH条件下只带微弱的负电荷，而且它的分子量又较大（为r球蛋白）。所以游动慢。更重要的是抗体分子受电渗作用影响较大，也就是说点渗作用大于它本身的迁移率。所谓电渗作用是指在电场中溶液对于一个固定固体的相对移动。琼脂是一种酸性物质，在碱性缓冲液中进行电泳，它带有负电荷，而与琼脂相接触的水溶液就带正电荷，这样的液体便向负极移动。抗体分子就是随着带正电荷的液体向负极移动的。而一般的蛋白质（如血清抗原）也受电渗作用的影响，使泳动速度减慢，但它的电泳迁移率远远大于电渗作用。这样抗原体就达到了定向对流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的沉淀线。

1．诊断血清：免抗人免疫血清

2．待检血清：人血清

3．阴性对照血清

4．PH8.6,离子强度0.05M的*缓冲液配置

               *钠     10.3克

               *       1.84克

               蒸馏水       1000毫升

5．缓冲琼脂板：将纯化的琼脂用PH8.6离子强度0.025的*缓冲液（用0.05M的*缓冲液稀释一倍即可）配成1.5%的琼脂，加入0.01-0.02%流柳汞防腐，保存冰箱内备用。

6．电泳仪

7．其他：生理盐水、打孔器、微量进样器。

1．琼脂板的制备根据需要可选用大玻板（6厘米×9厘米）和（小玻片）两种。大玻板约需琼脂10毫升，小玻片约需3.5毫升，凝固后按图打孔，方法同琼脂扩散试验。

2．加样：左侧孔内加患者血清（原血清及10倍稀释血清各占一孔），右侧内加抗血清，每片应有阳性对照。

3．电泳

用国产普通电泳仪。其内加0.05mPH8.6的*缓冲液，加至电泳槽高度的三分之二处，注意两槽内液面尽量水平。将加好样品的玻板置于电泳槽上，抗原端接负极，抗体端接正极，用2—4层滤纸浸湿作盐桥，滤纸与琼脂板联接处为0.5厘米。以板宽度计算电流，以板的长度计算电压。要求电流量为2—3毫安/厘米，即大板为20毫安，小板为10毫安。电压为4—6伏/厘米。通电45分钟—2小时后观察结果。

4．结果观察：在黑色背景上方，用散射光多个角度观察，在对孔之间有白色沉淀线即为阳性对照应出现明显的白色沉淀线。如果抗原，两极微沉淀条纹不清晰，于37℃保温数小时可增强沉淀条纹的清晰度。

5．影响结果的因素

（1）     抗原抗体的比例：抗原抗体比例适应时容易出现沉淀带，反之不易发生。当抗体浓度恒定时，被检血清含甲胎蛋白浓度高时，作10倍、20倍或更高倍数稀释可以提高阳性率。随稀释度的增加，抗原抗体的比例发生变化，沉淀线由靠近抗血清孔向逐步移向两孔中间，并可出现不典型的沉淀线如弧形、八字须形、斜线形，这些也是阳性，应予注意。

（2）     几组电泳缓冲液其电泳结果以*钠—盐酸缓冲液灵敏度zui高。*—*钠次之。Tris缓冲液更差。

（3）     电压与电流时电泳时间需要长些：电压电流增大时，电泳时间可更短。但电压过高则孔径变形，电流过大抗原抗体蛋白易变性，干扰实验结果。一般选择每厘米5毫升，电泳时间改为1.5小时。

免疫电泳实验是先将抗原物质在琼脂凝胶中做电泳分离，然后于凝胶槽中加入抗体血清。使抗原抗体进行双向扩散，在比例适宜部位形成特异的抗原抗体沉淀弧线。每条沉淀弧线代表一组抗原抗体复合物，故可用抗原成分分析；且可以根据其迁移率与抗体所出现的特异反应进行鉴定。

1．待检标本（抗原）：正常人血清。

2．抗体：正常人血清的家兔免疫血清。

3．1.5%离子琼脂（系用*缓冲液配制的）

4．电泳仪

5．*缓冲液：

*1.84克

*钠10.3克

蒸馏水1000毫升

pH8.6，离子强度（M）0.05

6．其它：载物玻片，直径3毫米打孔器，20mmⅹ2mm玻璃铸型，微量进样器。

方法：

1.取载物玻片（7.5ⅹ2.5厘米）加上3.5毫升1.5%琼脂凝胶，制成2毫米厚的琼脂板。

2.按图位置，在琼脂板未凝固时，放入抗血清槽铸型，注意勿使铸型全部浸入琼脂中，待凝固时再打孔。

3.加待检标本：用微量进样器往孔中加1—5微升。

4.电泳：电压9—7伏/厘米，泳动15—20小时。

5.电泳后取出抗血清槽铸型，加入抗血清，进行双扩散，一般在24小时内沉淀弧出全。

6．观察结果：或描绘、拍照或进行染色，染色后的标本便于结果分析及保存。

火箭电泳实际是一种定量免疫电泳。其原理为：在电场作用下，抗原在含定量抗体的琼脂介质中泳动，二者比例在合适时在较短时间内形成状似火箭或锥形的沉淀线，而此沉淀线的高度常与抗原量成正比关系，因此本法可以测定样品中抗原的含量。

1．诊断血清（抗体）：抗人IgG或IgA免疫血清

2．待检血清（抗原）：人血清

3．参考血清

4．pH8.6，离子强度0.05M*缓冲液配制（见对流免疫电泳试验）

5．其它：琼脂粉，微量进样器，打孔器，玻璃板，电泳仪

1．抗体琼脂板的制备

同单向扩散法，但注意稀释液应用pH8.6离子强度0.05M的*缓冲液。

2．打孔见下图

 

 

 

 

3．将用缓冲液稀释的适宜浓度的参考血清及适当稀释的抗原（人血清）分别加入各孔中，每孔10或20微升，要求加量准确而不外溢。

4．把加完样的免疫琼脂板放入电泳槽中进行电泳，电压4—6伏/厘米，电泳时间1—5小时，直到大部分抗原孔前端出现顶端尖窄而*闭合的火箭状沉淀线，关闭电源。

5．取下琼脂板，以抗原孔中心为起点，量出各火箭状沉淀线的高度。同单向琼脂扩散法绘制标准曲线，查出待检血清中Ig含量。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

当颗粒性抗原与其相应抗血清混合时，在有一定浓度的电解质环境中，抗原凝集成大小不等的凝集块，叫做凝集反应。

凝集反应广泛地应用于疾病的诊断和各种抗原性质的分析。即可用已知免疫血清来检查未知抗原，亦可用已知抗原检测特异性抗体。

颗粒抗原与抗体直接结合出现凝集现象叫直接凝集反应。

1．诊断血清：1：10稀释的伤寒杆菌诊断血清

2．菌种：伤寒杆菌、痢疾杆菌24小时琼脂斜面培养物

3．生理盐水、载玻片、毛细吸管

1．取清洁玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明号码。无菌操作下，用接种环于1、2格内加1：10稀释伤寒杆菌诊断血清1-2滴，第三格加1-2滴生理盐水。

2．无菌操作下，用接种环取伤寒杆菌培养物少许，混于第三格中，再混于*格中（不能先混*格再混第三格，因为这样将使诊断血清混入盐水而影响对照结果），将细菌与盐水或血清混合均匀使呈乳状液。此时取菌量不可过多，使悬液呈轻度乳浊即可。

3．同法取枯草杆菌培养物少许，于第二格内混匀。

4．轻轻摇动玻片，经1-2分钟后肉眼观察，出现乳白色凝集块者，即为阳性反应；仍为平等的乳浊液者，即为阴性反应。如结果不够清晰，可将玻片放于低倍显微镜下观察。

 为一种定量试验，用已知抗原检查血清中有无特异抗体，并测定其相对含量。

 材料：

1．诊断血清1：10稀释伤寒杆菌“H”血清，1：10稀释伤寒杆菌“O”血清。

2．菌液：伤寒杆菌“H”菌液，伤寒杆菌“O” 菌液。

3．生理盐水，小试管，吸管。

方法：

1．取洁净小试管14只分两排排列于试管架上，每排7只依次用蜡笔注明号码，于每管中分别加入0.5毫升生理盐水。

2．在第1排1管中加入1：10稀释伤寒H血清0.5毫升，于管内连续吹吸3次，使血清与盐水充分混合，而后吸出0.5毫升注入第2管，同样予以混匀后吸出0.5毫升注入第3管。依次类推，稀释到第6管，自第6管吸出0.5毫升弃去。此时，自第1管至第6管的血清稀释倍数为1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640。第7管不加血清作为对照。

3．同法用吸管吸取1：10稀释伤寒杆菌O血清加入第2排第1管，并依次如上法予以稀释。

4．用移液管吸取伤寒杆菌H菌液，加收第1排各管中每管0.5毫升（由盐水对照管开始，依次由后向前加入）此时血清稀释倍数又增加了一倍。

5．同法于第2排各管中加入伤寒O菌液0.5毫升。

6．将各管振荡混匀，放37℃水浴箱中2—4小时或37℃孵育箱中过夜次日取出观察结果。

观察结果：

1．观察切勿摇动试管，以免凝集块分散。

2．先看对照管，此管应无凝集现象，管内液体仍成混浊状态。但如放置时间较长，细菌堆于管底成小圆点状，为阴性反应。

3．试验管应自第1管看起，如有凝集时则于管底有不同大小的圆片状边缘不整齐的凝集物，上清则澄清透明或不同程度混浊。凝集的强弱可用“+”号表示如下：

“++++”凝集很强，管内液体*澄清，凝集块*沉于管底；

“+++”凝集强，管内液体不*澄清稍有轻度混浊，凝集块沉于管‍底；

“++”凝集中等强度，液体半澄清，凝集块沉于管底；

“+”凝集弱，管内液体混浊，少量凝集块沉于管底；

“－”不凝集，管内液体和对照管同样混浊，无凝集块。

4．轻轻振荡各管，观察凝集块的状态，对照管的细菌在振荡时呈烟雾状上升，随即消散，细菌分散仍呈混浊状态。“H”菌液的凝集块疏松呈棉状，大片沉于管底轻摇即升起，并极易破碎。“O”菌液凝集呈紧密颗粒状，沉于管底坚实致密，轻轻振摇不易升起，凝集颗粒较小不易摇碎。

5．记录观察的结果并制定凝集效价。通常以能产生明显凝集（++）的血清大稀释倍数作为该血清的凝集效价。如血清的zui低稀释度（即第1管1：40）仍无凝集应报告为低于1：40。如血清的zui高稀释度（即第6管1：1280）仍显*凝集现象。，应报该血清效价高于1：1280。

将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关的颗粒载体上，然后与相应的抗体结合，也可出现颗粒载体的凝集现象，称为间接凝集反应。间接凝集反应比直接凝集反应敏感性为高，可用于微量抗体或抗原的检查。

间接血球凝集试验是根据红血球表面的吸附作用而建立起来的。将细菌可溶性抗原提出使之吸附于红血球表面，此时红血球即称为“致敏红血球”。这种致敏的红血球具有细菌的抗原性，与相应的抗血清相遇可产生凝集现象。

间接血凝抗原的制备可用加碱或加热的方法使菌体中的多糖物质浸出，去除类脂以免干扰红血球的吸附作用。但如系蛋白质时则用来吸附的红血球需先用鞣酸予以处理。

1．抗原—伤寒杆菌O抗原

2．免疫血清：伤寒杆菌O901免疫兔血清

3．25%绵羊红血球悬液，生理盐水，试管吸管等

方法：

1．“O”抗原的制备：

将每毫升100亿的伤寒杆菌“O”菌悬液，置100℃水浴中2小时，离心沉淀吸取上清夜，分装无菌试管，放4℃冰箱备用。

2．致敏红血球悬液制备：

取一定稀释度的抗原加等量2.5%绵羊红血球悬液，混合后放37℃水浴箱中，每隔15分钟取出振摇一次，共经2小时。然后取出，用生理盐水洗涤3次，而配制成0.5%悬液即成。

3．试验步骤：

（1）小试管9只标好号码于试管架上。

（2）第1管加入0.9毫升生理盐水，其余各管各加入0.5毫升。

（3）以吸管吸取已加热灭菌的免疫血清0.1毫升加入第1管，混匀后吸取0.5毫升注入第2管，同样第2管的血清与盐水混匀后吸取0.5毫升注入第3管。如此依次稀释直至第8管。自第8管吸出0.5毫升弃去。第9管不加血清作对照。

（4）于每管加入0.5毫升已经致敏的0.5%绵羊红血球悬液，混匀后放入37℃水浴中2小时后观察结果。凡zui高血清稀释度的免疫血清试管中呈现*血凝者，即为该血清的间接血清效价。

若使可溶性抗原与相应抗体先混合，充分作用后再加入有关的免疫微球，因抗体已被可溶性抗原结合，不再出现免疫微球的被动凝集现象，叫间接凝集抑制试验，临床化验检查中常用的免疫妊娠试验就是一种间接凝集抑制试验。

妊娠试验：

孕妇尿中绒毛膜促性腺激素的含量比正常尿高。因此当往尿中加入抗绒毛膜促性腺激素抗体时，由于发生抗原抗体反应的结果，抗体被消耗，此时再往尿中加入胶乳抗原（吸附有人类绒毛膜促性腺激素的聚苯乙烯乳胶颗粒）。不发生反应，抗原仍呈乳状液体，即为妊娠试验阳性。反之，被检尿中绒毛膜促性腺激素含量甚少（非妊娠尿）不足以把加入的抗体消耗，当胶乳抗原加入后，抗体便与抗原结合发生反应。出现均匀细小颗粒，妊娠试验为阴性。

 

材料：

1．抗原：吸附有人类绒毛膜促性腺激素的聚苯乙烯抗原

2．抗体：抗人类绒毛膜促性腺激素抗体血清

3．被检材料：孕妇尿

4．正常尿作对照用

5．黑反应板1块

6．滴管3只

方法：

1．用清洁滴管在反应板上滴加一滴被检尿。

2．再往尿滴加抗血清一滴，轻轻摇动，充分混匀。

3．滴加一滴胶乳抗原，缓慢摇动3—5分钟，在较强光线下，观察结果。出现均匀一致的细小颗粒为阴性反应，怀孕。

注意事项：

1．试验材料用具用前使温度接近室温（20℃左右）

2．被检尿太混浊，需要小心过滤。

3．尿中有蛋白及血液时，不宜进行此试验。

金黄色葡萄球菌细胞壁成分中的A蛋白能与人及多种哺乳动物（猪、兔、羊、鼠等）血清中IgG类抗体 的Fc段结合。IgG的Fe段与SpA结合后，两个Fab段暴露在葡萄球体表面，仍保持其抗体活性和特异性当其与特异性抗原相遇时，也出现特异凝集现象。在以凝集反应中，金黄色葡萄球菌菌体成了IgG抗体的载体,称为协同凝集反应.本反应也可用于检测微量抗原.

A.      材料：

1.       抗原:可溶性伤寒杆菌O抗原

2.       免疫血清：伤寒杆菌0901免疫兔血清

3.       10%CoWan1株金黄色葡萄球菌（含大量蛋白A）的菌液

4.       PBS0.5%甲醛PBS，吸管、滴管、玻片等

B.      方法：

1．10%葡萄球菌菌悬液的制备：CoWan1株葡萄球菌接种于柯氏瓶，37℃培养18-24小时，用PBS洗下菌苔，每分钟2500转速度离心20分钟。沉淀菌用PBS洗两次后，用0.5%甲醛（用PBS配置）在室温中固定3小时。置于80℃水浴中4分钟以破坏菌体的自源性分解酶。再用PBS洗涤2次后配成10%菌悬液。

2．致敏葡萄球菌：

 1毫升10%的菌悬液加0.1毫升伤寒O抗血清充分混合放入37℃水浴中30分钟（中间需摇动两次）。取出后经每分钟2500转速度离心20分钟，弃去上清液，沉淀菌用PBS洗涤2次后配成10%菌悬液。

3．协同凝集试验

取伤寒“O”可溶性抗原一滴致敏葡萄球菌悬液，一滴在载波片上混匀，观察约2分钟。一般在几秒钟内即可发生凝集。

 ‚滴一滴致敏葡萄球菌悬液于玻片上，用接种环取伤寒O菌培养物少许置于悬液中使成均匀孔状，观察约2分钟，记录有无凝集。

ƒ用伤寒“O”杆菌培养物与未致敏的葡萄球菌菌液或用痢疾杆菌培养物与致敏的葡萄球菌菌液作玻片凝集，均为阴性反应，不出现凝集。

肠道杆菌中的许多细菌都有部分相同的抗原结构。因之一种细菌可与另一种细菌相应的抗血清发生交叉凝集反应。用一种过量的细菌抗原与发生交叉凝集反应的抗血清相结合。可将其共同抗体吸去，剩下抗体只能与特异性抗原起反应，这种试验即称凝集吸收试验。

利用凝集吸收试验可制备单价因子血清，以进行细菌抗原结构的分析及鉴定菌型。

1.       免疫血清：1：10稀释伤寒杆菌免疫血清。

2.       菌液：肠炎杆菌菌液，伤寒杆菌菌液。

3.       试管、吸管、毛细吸管。

1.      1/10稀释伤寒杆菌免疫血清分别与肠炎杆菌与伤寒杆菌进行玻片凝集，可见伤寒免疫血清与两种菌均有凝集，说明二菌具有共同抗原结构，故发生交叉凝集反应。

2.      将一定量的肠炎杆菌菌液加入1：10稀释伤寒杆菌免疫血清中，放37℃水浴箱中作用2小时，取出后离心沉淀，吸取上清夜，弃去沉淀。

3.      将吸收过的上清夜与稀释肠炎杆菌菌液做玻片凝集，观察结果。如仍有凝集时则将此上清夜再加浓肠炎杆菌菌液进行吸收，方法如上。

4.      重复吸收过的上清夜分别与稀释肠炎杆菌及伤寒杆菌菌液进行玻片凝集。如与前者无凝集而与后者有凝集，则表示伤寒杆菌免疫血清中的抗肠炎抗体已被*吸收。

 

 

 

 

 

 

 

 

免疫血清与其相应的抗原细胞（血球、细菌及其组织细胞相遇，并在补体的参与下可出现溶细胞反应。依抗原、抗体的种类不同可有溶血反应、溶菌反应等。

溶菌反应只在某些细菌中出现（如霍乱弧菌）。应用溶血反应是补体结合反应中不可少的因素。溶血反应是由于抗原（红血球）和抗体（溶血素）进行特异性的结合，并吸着了补体，而使红血球在补体的作用下被溶解，于是产生了溶血现象。

1.                 抗原：2%绵羊红血球。

2.                 抗体：溶血素

3.                 补体：取健康豚鼠血清作为补体。

4.                 小试管、生理盐水、水浴箱。

1．取小试管3只，按下表加入各物（容量单位为毫升）

2．将上述3试管放在37℃水浴箱内15—30分钟观察有无凝血现象。

当抗原与其对应的抗体结合时，所生成的抗原抗体复合物能从溶液中将补体吸着此即谓补体结合。参与补体结合反应的抗原是透明的溶液，故补体结合现象不能被肉眼看出来，因此必须借助溶血系统（溶血素及相对应的羊血球）作为指示剂，来判定媒质中有无游离的补体，近而推定媒质中未知抗原（或抗体）和已知抗体（或抗原）是否进行了特异性的结合。本反应具有很高的敏感性及特异性，因之常应用于传染病的诊断，特别诊断病毒疾病和梅毒。

 由于参与本反应的各种成分间有着一定量的关系，因此在作本试验之前，必须通过一系列的预备实验来确定各成分的使用量，故本反应的实验方法较为复杂。

本次实验以伤寒杆菌免疫血清与其相对应的抗原补体结合试验为例。

1.     抗原：伤寒的抽出液

2.     抗体：伤寒杆菌的免疫血清

3.     补体：豚鼠血清

4.     溶血素：抗绵羊血细胞的兔血清

5.     2%绵羊红血球

6.     小试管、试管架、水浴锅。

方法：

（一）预备试验（示教说明）

预备试验包括溶血素效价的滴定，补体效价的滴定，抗原效价的滴定及被检血清的处理。

（1）     溶血素效价的滴定

按照下表加入各物

 

 

凡zui高稀释度的溶血素可呈现*溶血者为一个单位。依上表结果第10管（即1：4000倍稀释）0.5毫升溶血素为一个单位，在溶血反应中常用0.5毫升中含有2个溶血素单位的溶液，所以试验时应取1：2000倍稀释的溶液。

（2）     补体单位滴定

依下表加入各试剂：

能引起*溶血的zui小补体量称为准确单位，上表中第3管（即0.3毫升），但因补体的效价可能有部分损失，故普通稍高的一管为实用单位，实际试验时须用两个实用单位。

上表的结果为：

补体标准单位：0.3毫升

补体实用单位：0.35毫升

补体两个实用单位：0.70毫升

因试验时是两个实用单位的补体0.5毫升，可依下列比例关系换算：

20：0.7=ⅹ：0.5

ⅹ= 14.3

即须将补体稀释14.3倍，用0.5毫升则含有两个实用单位。

（3）     抗原的滴定

在用已知抗原测定未知抗体时，必须先滴定抗原效价以决定本试验时所需抗原的zui适浓度（反之用已知抗体测定未知抗原时，则需滴定抗体效价）

 

如血清对照管呈*或部分不溶血是为抗补体现象。血清严重污染细菌，混有淋巴液或显著溶血时，常产生很强抗外体作用。又如试管、吸管不清洁，也可出现抗补体。若有抗补体发生，应抽血重试验。

 

 

 

 

淋巴细胞主要分T淋巴细胞和B淋巴细胞两大亚群，它们具有不同的特性和功能，为此在进行某些免疫学实验时，首先需分离出纯的T淋巴细胞和B淋巴细胞。本试验的原理为：淋巴细胞与用溴花二氨基异硫氢化物（简称AET）处理的绵羊红细胞（SRBC）混合后，其中全部T淋巴细胞均能吸附AET—SRBC，形成牢固稳定而巨大的E—花环，较正常未处理的SRBC形成的E—花环百分比为高，而且形成快速，不易脱落，重复性好。再经淋巴细胞分层液分离时，AET—E花环易沉于管底，而未形成E—花环的T淋巴细胞，用低渗液解花环周围的 AET—SRBC，便可获得纯T淋巴细胞，而B淋巴细胞可直接取自分层液的界面。

材料及试剂：

a）         新鲜豚鼠血

b）         兔红细胞（RRBC）

c）         溴花二氨基异硫氢化物（AET）

d）         淋巴细胞分层液

e）         其它Hanks液，含小牛血清的199培养液，无菌生理盐水，3.5%氯化钠溶液，离心机等。

方法：

1.     AET—RRBC制备

（1）. AET溶液的制备

称取AET粉剂402毫克，溶于10毫升蒸馏水中，使成为0.143M溶液，用4N NaOH溶液调pH9.0。该溶液必须新鲜配制，不宜久存。

（2）. AET处理RRBC

取洗涤好压积的RRBC，按一份压积AET—RRBC加入4份新鲜配制的pH9.0的AET溶液充分混匀置37℃水浴15分钟，每隔5分钟摇匀一次。取出加冷无菌生理盐水至离心管口（1—2厘米）1800转/分离心5分钟。连续洗涤3—5次，每洗一次，必须充分摇匀，以减少AET—RRBC粘附成团，并观察有无溶血。若有溶血现象，则用含小牛血清的199培养基再洗一次，zui后配成10%AET—RRBC悬液，置4℃保存，不得超过5天。

（3）.1%AET—RRBC的配制：

将预先配制并保存于4℃冰箱的10%浓度的AET—RRBC，以含10%小牛血清的199培养液稀释至1%。

2.     从新鲜豚鼠血液分离单个核细胞，操作见后试验。

3.     AET—E花环试验：

将分离的单个核细胞（2ⅹ10⁶/毫升）与等量1%AET—RRBC混合，置37℃水浴15分钟，每隔5分钟摇匀一次，分装数管，每管2—3毫升，低速离心（1000转/分钟）5分钟后，移至4℃冰箱45分钟。

4.     T淋巴细胞和B淋巴细胞的分离

将形成E—花环的细胞悬液，再用淋巴细胞分层液分离，吸取界面云雾状的细胞，即为富含B淋巴细胞群。沉淀于管底的E—花环，用Hanks液洗一次后，加双蒸水3毫升处理3分钟，低渗裂解E—花环周围的RRBC，立即加3.5%氯化钠溶液1毫升，使还原为等渗，低速离心沉淀，即得富含T淋巴细胞群。

 

 

 

玫瑰花环试验，又称为花结试验。是测定淋巴细胞数量和功能的一种方法。

人类T和B淋巴细胞表面具有不同的受体。由于人类T淋巴细胞表面具有与绵羊红细胞结合的受体，能与绵羊红细胞非特异性结合，形成E花环，因此，T细胞也成为红细胞花瓣形成细胞。根据E—玫瑰花环形成率，可以间接判断机体细胞免疫力。目前，已广泛应用于临床，作为测定人群免疫状态的一个指标。

1.     肝素（100单位/毫升）

2.     0.5%兔红细胞悬液（用Hanks液配制）

3.     吸收过的胎牛血清：

取经56℃30分钟加热灭活后的胎牛血清加半量压积兔红细胞混合后，37℃水浴20分钟，2000转/分离心10分钟，取上清液即成。

4.     Hanks液

5.     豚鼠抗凝血

6.     淋巴细胞分层液

7.     灭菌注射器，针头，试管，吸管等。

1.          淋巴细胞提取

（1）             取豚鼠抗凝血2毫升，加3毫升Hanks液使之稀释。加于3毫升淋巴细胞分层液液面之上（沿管壁轻轻加入，勿使两液相混）。

（2）           2000转/分离心30分钟，吸淋巴细胞层到另一试管中加5倍体积的Hanks液洗1—2次，（1500转/分离心10分钟）弃上清即成。

 

2.          加吸收过的胎牛血清0.1毫升，0.5%兔红细胞悬液0.2毫升，于淋巴细胞中。混合后，37℃水浴5分钟。

3.          500转/分离心5分钟，放4℃冰箱中2小时后，弃大部分上清。

4.          染色及观察

轻轻悬浮沉积的细胞。向悬液中滴一滴美兰液，混合，10分钟后取一滴放载玻片上，加盖玻片镜检。

高倍镜或油镜下计数200个淋巴细胞，凡结合3个或3个以上的兔红细胞者为阳性，计算花环形成细胞的百分率。

 

 

酶联免疫吸附试验是用酶标记的抗体（或SPA）检测未知抗原或抗体的方法。此法敏感性高，特异性强。常用的是ELISA方法，间接法，双抗体法和抗原法。本次试验介绍，酶联葡萄球菌蛋白A免疫分析法。ELISA法原理如下，见图9

1.          加抗原 使之吸附于固相载体（如塑料反应板）

2.          洗涤 加待测血清

3.          洗涤 加酶标记SpA

4.          洗涤 加酶的底物。经酶的催化产生有色产物。

1.          聚乙烯塑料反应板（PH9.6时可吸附蛋白Ag）

2.          抗原：伤寒杆菌O901煮沸或超声波粉碎抗原

3.          待测血清

4.          冻干酶联葡萄球菌A蛋白（HRD—proteinA）纯品

5.          邻苯二胺（OPD）

6.          包被液：0.05M碳酸钠—碳酸氢钠溶液PH9.6

7.          稀释液：10%免疫血清PBS—吐温20，防止非特异性吸附

8.          洗涤液：0.02MTrisTWeen20 ,Ph7.4防止非特异性吸附

9.          底物溶液：0.02M磷酸氢二钠25.7毫升

              0.1M柠檬酸24.3毫升

蒸馏水50毫升

临用前新鲜配制，在上述缓冲液中溶解40毫克邻苯二胺，然后加入30%双氧水0.15毫升，底物对光敏感，需要避光并立即使用。

10.       终止液；2M硫酸

1．抗原包被

取洁净的聚苯乙烯微量反应板，于每孔内加伤寒抗原0.1毫升（用包被缓冲液稀释，蛋白含量10微克/毫升），置37℃1小时，弃抗原液，用洗涤液3次每次3分钟。

2．加待测血清

于每孔内分别加不同稀释度（如1：5，1：10，1：20…1：80）的待测血清，PBS空白对照，阴性对照血清，阳性对照血清各0.1毫升。置37℃30分钟，洗涤3次。

3．加酶联A蛋白

于每孔加酶联A蛋白各0.1毫升，置37℃20分钟，洗涤3次。

4．加临时配制的底物溶液各0.1毫升，置暗处15分钟。加2M碳酸1滴终止反应。

5.结果判断：（肉眼判断）

若颜色于阴性对照相同则为阴性，若较阴性对照深则为阳性，根据颜色深浅以（+）表示。

取绵羊细胞免疫的小鼠脾脏，制成脾细胞悬液，与一定量的指示细胞（绵羊细胞）和补体结合，注入自制的小室内，经37℃孵育后，单个散在的抗体形成释放抗体，抗体与周围的绵羊红细胞（抗原）结合，并在补体参与下，使绵羊细胞溶解，结果在抗体形成细胞周围形成肉眼可见的圆形透明溶血区——溶血空斑。计算溶血空斑数目，则可推算脾内存在的抗体产生细胞总数。

1. 20—22克健康小鼠

2. 解剖器械

3. 注射器，平皿，漏斗，纱布，研钵

4. 20%绵羊红细胞悬液

5.  洁净脱脂载玻片（75ⅹ25毫米），盖玻片（22ⅹ22毫米）。

6. Ph7.2的Hanks液，凡士林油。

7. 微量加样器

8. 指示细胞悬液，配制方法如下：

10%绵羊红细胞 0.5毫升

补体（新鲜豚鼠血清）0.5毫升

含5%小牛血清的Hanks液 2毫升     混合后水浴备用

1．免疫动物

取25%绵羊红细胞悬液1毫升，无菌操作注入小鼠腹腔中

2．脾细胞液的制备

（1）小鼠免疫4天后，颈椎脱位处死，取脾脏，去除脂肪组织，放平皿内，用冷Hanks液洗1—2次。

（2）取出脾脏研钵中研碎，加Hanks液2—3毫升，用吸管反复吹打数次，使细胞分散。将此细胞悬液经4—8层纱布过滤，1500转/分离心5分钟，弃上清。

如细胞太多，可加蒸馏水4毫升迅速混匀，半分钟后立即加入等量Hanks液混匀1000转/分离心10分钟，弃上清。

（3）沉淀细胞用Hanks液洗1—2次，弃上清后，加Hanks液使总量达5毫升。用乳头吸管吹打使沉淀细胞悬起混匀，此即为50倍稀释的脾细胞。

（4）取此悬液0.1毫升放另一小试管中然后加0.9毫升Hanks液使成500倍稀释的脾细胞悬液。

*脾细胞悬液制备过程中应在冰水浴中进行。

3．玻片小室的制作

取洁净（无油）的载玻片，按下图粘三条透明胶带，在胶带上薄涂一层凡士林（勿涂到小室内），然后用镊子取两个盖片，分别放在其上，制成两个小室。用镊子尾端将盖片压平贴牢（保持小室一定体积）。用凡士林将盖片底端（其中的任一端）封住，顶端作为注入细胞混合液。

4．细胞混合液的配制

取小试管一只，用1毫升吸管吸取0.2毫升指示细胞悬液，用另一吸管吸取0.2毫升500倍稀释的脾细胞悬液，混匀即为被检的细胞混合悬液。

5．混合细胞的灌注

用100ul的微量加样器吸取被检细胞混合悬液，于小室开口一端轻轻将液体注满小室（勿使气泡产生，勿使液体外溢），记录实际注入的细胞悬液微升数（约70ul）

每个样品注2个小室，取其平均值。

6．用牙签粘取少许凡士林益封小室开口。

7．将作好的标本水平置湿盒中，放37℃温箱中孵60分钟

8．溶血空斑计数

肉眼观察空斑并计数两个小室出现的溶血空斑数。对模糊不清的空斑可在低倍镜下检查，真正的溶血空斑必须中心有一个淋巴细胞，周围为透明区。

全脾脏中抗体产生细胞总数可依下述公式计算：

抗体是机体接受抗原刺激后产生的一种具有免疫特异性的球蛋白。在免疫学实践，为制备抗体常以抗原性物质（细菌、病毒、类毒素、血清及其他蛋白质）给动物注射。经过一定时间后，动物血清中可以产生大量的特异性抗体。这种含有特异性抗体的血清称为免疫血清。免疫血清不但对传染病的诊断、预防和治疗有重要意义，而且对器官移植，肿瘤以及某些科研工作也有重要意义。

抗体的产生通常与抗原的质和量、动物种类以及接种途径有密切关系。因此在制备免疫血清时要根据抗原的不同选择适宜的动物种类和免疫方法。

材料：

1.         动物：家兔

2.         菌种：伤寒杆菌H901，伤寒杆菌O901

3.         培养基：普通培养基

4.         其它：0.5%甲醛盐水，0.5%石灰酸盐水，无菌生理盐水，标准比浊管，离心机。

1.         抗原的制备：

标准菌株的选择：所用的菌种伤寒杆菌H901和伤寒杆菌O901应具有典型形态菌落及生化反应。在生理盐水中不发生自身凝集，与特异血清有高度凝集者可作为菌种。

2.         菌液的制备

Ⅰ.原液制备：

H菌液的制备：将合格的伤寒杆菌H菌株接种于普通琼脂的克氏瓶或大试管内 37℃孵育18—24小时。肉眼观察有无杂菌生长，必要时作镜检。用无菌甲醛生理盐水洗下菌苔，将洗下液体装入无菌试管内，置37℃恒温箱18—24小时以杀菌。得到原液。用作无菌试验即将菌液接种于肉汤及琼脂培养基培养4天，无活菌生长者才可使用。

O菌液的制备：将合格的伤寒杆菌H菌株依上法培养后，用无菌0.5%石灰酸盐水将菌苔洗下，洗液装入无菌试管置于37℃温箱中18—24小时杀菌得原液。经检查无菌时可以使用（如无伤寒杆菌O菌株也可用H菌株制备O抗原。即用0.5%石灰酸生理盐水洗下H菌菌液置100℃水浴60分钟，破坏其H抗原即为O菌液。

Ⅱ.应用液的制备：

合格的原液用标准比浊管计算含菌落数目后，用生理盐水稀释至每毫升含菌10亿。是为了应用液加入适量甲醛使其为0.25%，制备好的原液及应用液均保存在2—10℃冰箱中备用，有效期为1年。

菌液浓度的计算及稀释法：

菌液的浓度可用麦克法伦特氏标准比浊法来测定，方法如下：

（1）       分别配制1%硫酸溶液及1%氯化钡溶液

（2）       取口径相等质地相同的试管10支，依下表所示分别将硫酸及氯化钡溶液加入，封固管口，注明号码备用。

 

（3）       将洗下的细菌原液放入与比浊管相同的试管中并予以一定稀释。与标准比浊管相比较，视其浊度相当于比浊管的第几管，然后将比浊管相当菌数乘以稀释倍数即可得到每毫升中所含细菌的数量。如细菌原液1：5稀释后其浊度与第3管相当，则原液每毫升含菌数为9ⅹ5=45亿。

（4）       菌液的稀释可按下列公式计算：

欲得稀释液浓度— 原液毫升

如原液5毫升，每毫升含菌45亿今欲稀释为每毫升含菌10亿的溶液应加生理盐水的毫升数：（5×45）/（10-5）=17.5毫升

即细菌原液5毫升加生理盐水17.5毫升稀释即成。

3．免疫方法

（1）       选择体重2—3千克的健康雄兔2—3只，由耳静脉采血1毫升，分离血清。与进行免疫用的细菌做凝集试验，测定有无天然凝集素。如无或微量时，该动物可用于免疫。

（2）       将已稀释的抗原按以下剂量及程序注入兔耳静脉。

 

（3）       末次注射后7天耳静脉采血1毫升，分离血清。用上述菌液作试管凝集试验，滴定抗菌血清中抗体的效价，效价在1：2000以上可放血。若效价不高可再增量注射菌液1—2次，再行试血。试血合格可颈动脉放血（方法见附录）。分离血清，加入防腐剂（如万分之一的硫化汞）放4℃保存备用。

1．      动物：家兔

2． 红细胞悬液

3． 其它：无菌生理盐水，保存液（阿氏液）等

2.        红细胞悬液的制备

（1）     采血

采取的绵羊血与灭菌的保存液等量混合，置冰箱中，可保存数周，也可用抗凝方法

（2）     洗涤血球

先将抗凝血液离心沉淀（2000cpmⅹ5分钟）吸去上清。加入2—3倍的生理盐水并用毛细滴管反复吹打混匀，离心沉淀5分钟，吸去上清液。如此连续洗3次，zui后一次可离心沉淀10分钟以使血球密集管底。直至上清液透明无色再吸去上清夜，留密集血球备用。洗涤4次则血球变脆不适于使用。

（3）     用生理盐水将红血球配成需要浓度，即为试验用的血球悬液。如需10%血球悬液时，则吸取1毫升洗涤后的红血球加生理盐水9毫升即成。

3.        免疫方法

（1）       选择2—3千克健康雄兔，按如下剂量及程序免疫：

 

（2）       末次注入后7天，耳静脉采血1毫升，滴定血液单位达1：2000以上可颈动脉放血，分离血清，放等量甘油防腐，分装无菌安瓶，贮于4‍‍℃中备用。

材料：

1．动物：家兔

2．人血清

3．羊毛脂、石蜡油、卡介苗。

4．其它：无菌生理盐水，无菌研钵等。

1．弗氏佐剂的制备

将羊毛脂与石蜡油按1：5比例混合，高压灭菌。

2．人血清——弗氏*的制备

将灭菌佐剂一份置研钵中，边研磨边滴加等量的含卡介苗3—4毫克/毫升的抗原液，使成油色水乳剂，研磨要充分，使乳剂滴入冰水中不扩散。

3．免疫动物

可采用一次性免疫法，即将抗原与佐剂制成的乳剂分多个点兔背部皮肤，也可注入足底2—4针各0.45毫升，总量约3毫升，一个月后试血。

脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分，所以抗脂多糖抗体的制备可用革兰氏阴性细菌菌体抗原来制备，因此这里只介绍几种细菌脂多糖提取的方法。

原理是将细菌悬液加于热酸——水混合液中，冷却，离心混合液可分为水溶液层，内含水溶性脂多糖及核酸等及酸层、内含蛋白质。近年来发现在酸层中也含糖类。经离心后沉淀含细胞残体。

1.         细菌浓悬液用盐水经2500转/分，20分钟离心洗涤一次。

2.         将沉淀的菌混匀于蒸馏水中，放66℃水浴，然后滴加等量的90%热酚溶液（预热至66℃），边加边摇，而后在66℃水浴中搅拌25分钟

3.         在水浴中冷却，于4℃冰箱过夜

4.         以2000转/分离心15分钟

5.         将上层水溶液吸到另一试管中

6.         剩下的酚层及残渣组分可再加上述同量水在热水浴中搅拌30分钟，冷却，离心，取上层水溶液。将两次提的水溶液混合，置透析袋中于生理盐水中透析2天，其间换几次盐水，以除去酚。

7.         透析后的水溶液层经浓缩（如用聚乙二醇在透析袋外层涂抹以除去水分）。即成粗制脂多糖，于冰箱内保存备用。

1.         获得的菌液经2500转/分，20分钟离心洗涤1—2次，将沉淀配成2倍于湿菌浓度的浓菌液。

2.         用超声波发生器中频（约相当于12000cps）处理20分钟。

3.         处理液经3000转/分，离心30分钟，吸取上清液即为脂多糖抗原。置4℃冰箱保存备用。

将培养后得到的浓菌液沸水浴煮沸2小时。置冰箱静置两星期以上（使菌体残渣自由下沉）。3000转/分离心30分钟，取上清夜即为粗脂多糖抗原，置冰箱中保存备用。

观察机体的非特异免疫现象；加深理解机体的天然免疫机制。

机体的天然免疫机制是通过机体在种族进行过程中由于不断与病原微生物进行斗争而建立起来的。这种天然获得的免疫性首先表现在种的免疫上，如不同种动物对某些感染具有先天的抵抗力。

机体的天然免疫机构对消灭侵入的微生物具有重要的作用。如皮肤与黏膜是抵抗外来侵害的*道屏障。皮肤具有机械的阻挡作用，黏膜可分泌许多液体，如泪液、唾液、胃液、肠液等，其中喊含有溶菌酶，可溶解和杀死细菌。正好血清中也含有许多杀菌的因素，如补体。乙型溶菌素及备解素系统等，可杀死革兰氏阴性或阳性细菌。血液中的白血球及巨噬细胞对外来异物有吞噬及消化的作用，这种作用也是天然防御中的重要机制之一。

1．血清：新鲜无菌免疫血清

2．菌种：伤寒培养液

3．无菌小试管无菌吸管：琼脂平板37℃水浴箱无菌生理盐水方法

1．取无菌小试管2支，分别注明1、2号。

2．用吸管取新鲜无菌兔血清0.5毫升，加入第1管内。

3．用另一支吸管吸取无菌生理盐水0.5毫升，加入第二管内。

4．再用吸管吸取伤寒杆菌培养液，分别加入1及2管中各0.1毫升。加菌液时，防止菌液接触管壁以免污染管壁，造成结果的错误。然后振荡两支试管使之均匀混合，置37℃水浴箱中。

1．    取普通琼脂平板一块，用蜡笔在底上划分为四等分，分别标记为10'，30'，60'，对照（如图）。 待血清与菌液作用10分钟后，取出1号试管加以加以振荡，使细菌均匀悬于液体中，然后采一接种菌液划线接种于培养基10'部分，再将试管放回水浴箱中继续培养。于30分及60分后，再取出1号试管各采一接种环菌液分别划线接种于培养基相应部分。2号试管只于作用60分钟取出，采一接种环菌划线接种于培养基的对照部分。

2．    将平板放37℃温箱中培养24小时。观察各试验部分及对照部分生长的细菌菌落数目。分析经血清与生理盐水作用后细菌死亡情况及其与时间的关系。

唾液里含有溶菌酶，能溶解革兰氏阳性菌，是机体非特异性免疫因素之一。溶菌酶对于革兰氏阳性菌的作用在于裂解细胞壁中的乙酰胞壁酸和乙酰葡糖胺之间的连接，可导致细菌死亡。测定体液中溶菌酶含量的变化，认为可以反映非特异性免疫功能一个方面。

1．    细菌培养物

2．    0.85%无菌生理盐水

3．    小试管2支；平皿1个；1 ml移液管 3支

1．试验前一天，将细菌移种普通斜面37℃培养24小时，用生理盐水洗下菌苔稀释至适当浓度（722型分光光度计上波长450纳米 光密度0.4）。

2．唾液流入无菌平皿内，以备用。

3．    取2支小试管，加菌液0.5ml，向*管加唾液0.3 ml，向第二管加唾液0.3 ml作为对照。将两支小试管放37℃水浴箱保温30分钟。

观察结果：

第1管 澄清透明， 第2管仍浑浊

1．动物——小白鼠

2．菌种——甲型链球菌菌液

3．无菌注射器及针头，玻璃毛细管，美兰染液，玻片，无菌肉汤，灭菌小棉花包。

方法：

1．    试验前3—6小时。将无菌肉汤2—3毫升注射入小白鼠腹腔内引起大量白血球聚集于小白鼠腹腔内。

2．将1ml甲型链球菌菌液注入小白鼠腹腔。

3．注射后用毛细吸管轻轻刺入小白鼠腹腔吸取腹腔液。经5ˊ、10ˊ、20ˊ、40ˊ后，分别取腹腔液滴于玻片上制成涂片，经自然干燥后，用稀释的美蓝液染色一分钟后镜检。

4．镜检时寻找白血球，观察细胞染液中有无吞噬的细菌。

结果观察：

细菌及细胞核呈深兰色，细胞浆呈淡兰色，在不同时间的涂片中，可看到处于不同阶段的吞噬现象。

（二）巨噬细胞吞噬红血球的作用（示教）

1．动物 小白鼠

2．25%鸡红血球悬液，1%可溶性淀粉，无菌注射器及针头。

1．48～72小时以前无菌浆糊1ml注入小白鼠腹腔内。

2．48～72小时之后在腹腔注入25%洗涤过的鸡红血球悬液1ml。

3．血球注入后经30分钟至1小时后，用毛细管取腹腔液制成涂片，待干后用瑞氏染液染色镜检。

4．同法于1小时、2小时后再作一次腹腔液涂片染色镜检。

结果观察：

鸡红细胞呈椭圆，有细胞核，经染色后胞浆呈粉红色，核呈紫蓝色。一个巨噬细胞可吞噬数个鸡红细胞，吞噬后经消化的鸡红细胞轮廓不清。

1.         用消毒好的注射器，按无菌操作法抽菌悬液后，再用无菌镊子夹一灭菌棉花包，将针头刺入棉花包内，排出注射器内的气泡，然后将注射器平担于试管架上。

2.         固定小白鼠：用右手轻拖鼠尾，使其趴在金属网盖上，再突然用左手拇指和食指抓紧小白鼠颈部及两耳，将鼠体收入手掌中，再用左手无名指和手掌夹住小白鼠尾根，以无名指和小指夹住其左腿。

3.         以无菌镊子取碘酒棉球，消毒小白鼠左下腹部，用镊子取去注射器针头上的棉花包放入消毒罐中。左手倾斜使小鼠头部向下，然后将注射器针头自小白鼠左侧腹股沟部刺入皮下，使针头在皮下组织内前进约1厘米左右，再直立注射器，轻轻向下刺入腹腔内（这样可防止拔针后注入的材料外溢）。注入菌液1毫升后将针头退出。然后将小白鼠用染料作好标记。如用复红（红色），美蓝（兰色）放入动物罐中。

50%溶血试验即求得能使50%致敏羊红细胞发生溶血的zui小量血清，然后计算出每毫升血清中补体含量。

溶血百分数

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

          1           2          3           4      补体量

 图12由溶血素致敏洋红细胞的溶血程度与肠鼠血清（补体）量增加之间的关系

以补体量作为横坐标，溶血百分数作为纵坐标，可得到一个清晰的“S”形曲线。在50%溶血周围，线段近似一条直线。因此当补体用量稍有变动，就可对溶血程度发生很大影响。所以用50%溶血作为终点要比100%溶血更为敏感。

50%溶血试验定血清中补体含量用以下公式表示：

 

该公式可以从Von Krogh 方程式进一步加以论证：

 

 假定X=加入的新鲜血清量

      y=溶血的百分率，以小数表示

      V=斜率

      k=常数

 

转变成对数，上述公式就变成

当以50％溶血作为终点时，，代入上述公式，，由于－log1＝0，，也即表示补体的50％溶血单位就是加入的新鲜血清量。

 

1．稀释液（磷酸盐缓冲生理盐水）

NaCl                        17g

Na₂HPO₄                               11g

KH₂PO₄                      0.27g

蒸馏水                      100ml

使用时取此原液50ml，加90ml蒸馏水。经高压灭菌后即可使用。加入100%硫酸镁溶液1ml，可增强补体的效能。

2．绵羊红细胞悬液（1×10g/ml）

3．溶血素（2U）

4．被检血清（新鲜豚鼠血清）

5．水平离心机

6．水浴箱

7．721型分光光度计

1．浓度为1×10g/ml的绵羊红细胞配制

取经稀释洗涤后的绵羊红细胞配成较5%稍浓的细胞悬液。

取50%细胞悬液1ml，加于14ml蒸馏水中测值为。按下式求出于一定体积的5%细胞悬液中应加入稀释液的毫升数。

 

 

为配制的50%细胞悬液体积，为于一定量5%细胞悬液中应加入稀释的ml数：为已知标准化的１×100个细胞／ml悬液的 ₅₄₀值─0.385。

 

２．致敏绵羊细胞

取绵羊红细胞悬液（1×10^２／ml）加等量的溶血素（２U／ｍｌ）。充分混合。置37℃水浴中作用３０分钟，每隔10分钟摇动一次以免细胞下降即成5×10^８／ml致敏羊红细胞。

３．补体CH50单位测定

 

 

⑴　按下表加样：

 

⑵　将各管充分混合。置37℃水浴中６０分钟（摇动１～２次，以免红细胞下沉。）

⑶从水浴中取出后，立即将各管以２０００转／分离心１０分钟，将各管上清液分别移于另一试管。

⑷测定各管上清液ＯＤ值（波长＝５４０ｎｍ）

４．补体ＣＨ５０单位的计算

从测定管（第１～５管）及溶血对照管（第６管）的ＯＤ值中减去红细胞对照管（第７管的ＯＤ值。再减去按待测血清每管实际用量计算出的血清色度ＯＤ值（８０／８００ⅹ该管实际量ⅹ第８管ＯＤ值）。即为测定管的校正ＯＤ值。然后计算各测定管的溶血率（ｙ值）

再计算各管的ｙ／（１－ｙ）值。

在双对数坐标纸上，以ｙ／（１─y）值为横坐标，血清用量为纵坐标，得到一条直线。由于50%溶血（y=0.5）的y/（1─y）值等于1。即可由横坐标等于1的一点，在直线上求得在纵坐标上相应的截距，此即产生50%溶血的待测血清实际用量。

    zui后，按下列公式计算出每毫升待测血清的总补体活性，以单位/毫升表示之。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

病毒的血清学反应与其他微生物的血清学反应相同，即可已知抗原测未知抗体或用已知抗体测未知抗原。常用的方法有血凝抑制、补体结合等。

病毒导致红细胞凝集的原因还不十分清楚，但对流感病毒的血凝一般解释为病毒包膜上的血凝素，作用于红细胞表面的受体而产生凝集现象。已知能与流感病毒发生血凝现象的动物红细胞至少有22种。其中以鸡、豚鼠、人的红细胞应用得zui多。而在血球与病毒混合前加入病毒的特异性抗体，则血球凝集现象不出现，此称血球凝集有抑制现象，借此可以鉴定病毒或测定体内的抗体。

 

1.                新城鸡瘟病毒

2.                0.5%鸡红细胞

3.                抗鸡瘟病毒血清

4.                生理盐水、大孔塑料板、小孔塑料板

5.                稀释棒：0.05ml（用于血凝），0.025ml（用于血凝抑制）

6.                定量滴头：1ml注射器上加16号针头，经其口滴出液体1滴相当于0.025ml。

 

一．血球凝集

依下表加入各样品（单位：ml）

结果判定：观察结果，切勿将板振摇，应轻轻拿起，观察孔底。凡出现凝集者，血球沉于孔底呈平铺象倒张的伞状，边缘有卷起的趋向。阴性者，血球孔底形成一个小团，光滑圆润，边缘整齐者。

各孔凝集结果以+++，++，+，-表示

++++全部血球凝集，一层红细胞均匀铺于孔底，呈颗粒状薄膜，边缘不整齐。

+++基本同上，大约75%血球凝集，但边缘不整有下垂趋向者。

++约有50%血球凝集，血球在孔底形成环状，四周有小凝集块。

+约有25%血球凝集，血球于孔底形成一个小团，四周有小凝集块。

-不凝集，血球沉于孔底中心，呈一致密的圆点，光滑圆润。

凝集效价：能使血球呈++凝集的病毒zui高稀释度为凝集效价，即含一个血凝单位，实用时应用0.5毫升病毒悬液中含4个血凝单位。若血凝单位为1：320，故抗原稀释度应为1：80，由于试验时用量为0.25毫升，故含4单位应为1：40。

依下表加入各种品（单位：ml）

 

zui高稀释孔仍呈*抑制凝集，该血清稀释度即为血凝抑制效价。

 

1.           滴定血凝效价：先用定量滴头按下表，第1孔加8滴，其余每孔加2滴，然后用大号螺旋圈吸满病毒液顺次稀释至第10孔。每孔加0.5%鸡血球2滴。下表内的单位为滴数。

 

 

 

2.           室温静置30—40分钟后肉眼观察结果，必要时可用放大镜观察，计算结果与试管法同以++为终点。

3.           血凝抑制试验：将试验血清按下表稀释，首先按表滴数加生理盐水，然后加入第1、第2及第3孔以试验血清，用小号螺旋圈顺次稀释。

 

 

 

 

 

 

 

血清稀释完毕后，加入病毒稍加振摇后，zui后加入0.5%鸡血球悬液各2滴，置室温30—40分钟观察结果，观察方法与试管法相同。

塑料板法的优点为操作简便，节省材料，适用于大规模血清学试验之用。

 

致敏的T淋巴细胞与相应的抗原反应，能引起代谢活化，并释放出多种有生物活性的物质。其中有抑制单核，巨噬细胞移动的因子（MIF）及抑制多型核白细胞移动的因子（LIF）。正常淋巴细胞无此反应。欲知人或动物是否存在对某种抗原的致敏T细胞——特异的细胞免疫反应，可将其淋巴细胞与抗原一起培养，从有无MIF或LIF产生来做判断。这两种细胞免疫反应（MMIF）（或迟发型变态的反应）的体外检查法分别叫做单核细胞移动抑制试验或白细胞移动抑制试验（LMIF）。人体多采用LMIF检查。

检查白细胞移动抑制因子的存在，是借其抑制白细胞移动的生物活性为指标的，依观察白细胞移动的方式不同，移动抑制试验有三种不同的方法，即毛细管法，琼脂糖打孔法及琼脂糖微滴法，这里介绍毛细管法。

将有特异细胞免疫（致敏）人的白细胞（包括各种白细胞）装入毛细玻璃管中培养，24小时后，白细胞从管中向外移动呈扇状，若培养液加入相应的抗原，能使致敏T细胞放出LIF，白细胞就不能或不能充分从管中向外移动。与不加抗原的对照相比较，显示出白细胞移动受抑制的现象。

1．     抗原：抗原种类因实验目的不同而选定，用细胞培养液配成一定浓度供使用。本试验采用结核杆素或pHA。

2．     豚鼠抗凝血清

3．     毛细玻璃管：内径为0.8~1mm。两端粗细一致。长7.8cm

4．     细胞培养液：199培养液或1640培养液。

5．     培养小室或盖片

6．     Hanks液。

7．     淋巴细胞提取液

8．     离心机、试管、滴管等。

1．     淋巴细胞提取：同E形花环试验

2．     用无菌镊子夹毛细管，插入细胞悬液中，使细胞悬液借毛细管现象进入毛细管内，在离上端7~8mm时，将毛细管取出，装入各毛细管中，使细胞悬液高度力求相对等。

3．     将毛细管空端经火焰封固端朝下置试管中，于水平离心机内1000转/5，10分钟。取出毛细管可见细胞被压紧里4~6mm高的柱，表层发白主要是白细胞，下层发红为红、白细胞混合存在。用小砂轮在毛细管壁的细胞——液体界面处划痕，小心折断。将溢满细胞的毛细管蘸少许凡士林，置平底凹玻中固定，每凹放2~8只毛细管，而后滴加培养液，将毛细管分为两组，每组3~4支，一组为实验组，另一组为对照组。试验组用199培养加适量抗原作培养液，对照组只用199液作培养液，不加抗原。

4．     凹孔上加盖玻片封闭，勿留有气泡，将凹玻片置于铺有湿布纱布的铝盒中，置37℃温箱中培养18~22hr。

5．     取出凹玻片，用解剖显微镜测定各毛细管白细胞移动的扇面之长短直径。试验结果用移动指数MI表示：

正常值80~120%

        80%以下皆为抑制，即移动抑制阳性。

        120%以下皆为刺激，刺激反应的产生可能是抗原浓度偏低。

 

 

 

正常机体的T淋巴细胞在体外培养过程中受到特异性抗原或有丝分裂原刺激。可转化为淋巴母细胞。细胞免疫缺陷时，患恶性肿瘤或某些其他疾病时。转化率显然降低。目前zui常用植物血凝素（PHA）作为分裂原来检测受试者的淋巴细胞转化率，从而判定其细胞免疫功能，称为PHA刺激淋巴细胞转化实验。

（1）           肝素（每毫升含100单位）

（2）           199培养液（内含20%灭活小牛血清。青霉素100单位/毫升链霉素100微克/毫升）

（3）           PHA（每毫升含1000微克）

（4）           无菌注射器及针头、试管、吸管。

（1）     采肝素抗凝血1—2毫升（1毫升血中加肝素20单位）充分混匀。37℃静置1—2小时。红细胞沉淀后，吸取血浆层并捎带些红细胞。移入另一无菌试管中。计算白细胞数然后2000rpm离心10分钟。弃上清液。用199培养液将沉淀的白细胞配成1ⅹ10⁷/毫升细胞悬液。

（2）     取细胞悬液0.6毫升（6ⅹ10⁶细胞）加入含有2.4毫升199培养液的培养瓶中。

（3）     按每毫升营养液加30ugPHA加入PHA。

（4）     37℃孵育68—72小时。培养过程中，每天翻动培养瓶1-2次。

（5）     培养后。振荡培养瓶。将细胞重新悬起，然后移入试管中。

（6）     1000rpm离心5分钟。

（7）     尽量弃去上清液，将沉淀物混匀，取一滴放在载玻片上，推成血膜（头、体、尾分明）干燥，用瑞特氏染液染色）镜检。

（8）     计算淋巴细胞的转化率：油镜下观察每张玻片的头、体、尾三段。每段各一纵列（目的是减少推片中细胞分布不均的误差）。

每张玻片记数200—400个细胞，计算转化率其中头部50—100，体部50—100，尾部100—200细胞。

一般认为转化率的正常值为60—70%

淋巴细胞的转化标准

实验六 NK细胞活性测定

    一．放射性核素释放

实验原理： 用放射性核素标记靶细胞，当靶细胞受到破坏时，放射性核素被释放出来，通过测定释放或残留在未被破坏细胞内的放射性核素放射活性，即可计算和推测杀伤细胞的细胞毒活性。常用的放射性核素有⁵¹Cr、³H-Dr、¹²⁵I-UdR等。本实验采用⁵¹Cr释放法检测人NK细胞活性。

Na⁵¹Cr O₄半衰期为27.7天，当其进入增殖期靶细胞内，可与胞浆内的大分子物质（如蛋白质）结合，是靶细胞被标记。当标记⁵¹Cr细胞受到损伤或死亡后，即可释放出胞内⁵¹Cr。⁵¹Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到培养上清中⁵¹Cr的放射计数率（cpm），即可推算出NK细胞活性。

 试剂与材料

（1）2%十二烷基硫酸钠（SDS）：用无菌生理盐水配制。

（2）0.5%台盼蓝染色液：取0.5g台盼蓝粉末，加生理盐水100ml。

（3）铬酸钠（Na⁵¹Cr O₄）.

（4 ）96孔U型细胞培养板、解剖用具、离心管、平皿、消毒用品等。

（5）靶细胞：K562细胞株、人NK细胞敏感株。

（6）效应细胞：人外周血单个核细胞（PBMC）

 操作流程

（1）靶细胞制备：取传代培养24~48小时对数生长期的K562，用RPMI-1640培养液洗涤2次，用10%FCS-RPMI-1640培养液调细胞浓度4×10⁶/ml。0.5mlK562细胞悬液加3.7~7.4MBq（100~200uCi）⁵¹Cr,5%CO₂,37度孵育90分钟，每个15分钟振摇一次。RPMI-1640培养液洗涤3次，洗去未标记的游离⁵¹Cr。10% FCS-RPMI-1640培养液调细胞浓度1×10⁵/ml，同时检测细胞的⁵¹Cr标记率，一般要求标记率＞0.1cpm/cell。如暂时不用，可放置4度保存12小时。

（2）效应细胞制备：淋巴细胞分层液分离人PBMC，10%FCS-RPMI-1640培养液调细胞浓度1×10⁷/ml

（3）加样：取上述效应细胞和靶细胞各0.1ml（E：T=100：1）加入96孔培养板内，3复孔。同时设自然释放对照孔（0.1ml靶细胞+0.1ml10%FCS-RPMI-1640培养液）和zui大释放孔（0.1ml靶细胞+0.1ml2%SDS）。37度，5% CO₂孵育4小时。

（4）测定：1000r/min离心培养板5分钟，用微量移液器吸出各孔上清0.1ml，加于计数管内，用γ计数仪测定放射活性cpm值。

 （5）计算：根据下式计算⁵¹Cr自然释放率和NK细胞毒活性：

       ⁵¹Cr自然释放率（%）=（自然释放孔cpm值）/（zui大释放孔cpm值）×100%

       NK细胞毒活性（%）=（试验孔cpm值-自然释放对照孔cpm值）/（zui大释放对照孔cpm值-自然释放对照孔cpm值）×100%

    4．操作关键

    （1）靶细胞的质量非常重要，用台盼蓝拒染色法检测K562靶细胞的存活率应＞95%。标记后的自然释放率应＜15%。

    （2）效靶细胞比率一般选择50~100：1，其自然杀伤率不再呈对数增加，标本用量过大。

    （3）由于放射性核素具有毒性，标记的靶细胞不宜放置过久，与效应细胞作用时间也不宜过长，因随时间的延长死细胞增多，自然释放率也随之增高。

 

实验原理 乳酸脱氢酶（LDH）存在于细胞内，正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，由于细胞膜通透性改变，LDH可从细胞内释放至培养液中。释放出来的LDH再催化乳酸的过程中，使氧化型辅酶‍Ⅰ（NAD＋）变成还原型辅酶（NADH2），后者再通过递氢体－吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化氮唑蓝（INT）或硝基氯化四氮唑蓝（NBT）形成有色的甲基化合物，再490nm或570nm波长处有一吸收峰，利用读取的A值，即可测得杀伤细胞毒活性。

   （1）PBS（pH7.4）：NaCl 8.0g, KH₂PO₄ 0.2g, NaHPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，加去离子水至1000ml溶解。

   （2）1mol/L乳酸钠溶液：取11.2g乳酸钠溶于100ml去离子水。

   （3）LDH底物溶液（临用前配制）：

       NBT（硝基蓝四氮唑）        4mg

NAD＋（氧化型辅酶Ⅰ）      10mg

 PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐）     1mg

 加蒸馏水2ml溶解，混匀后取上清液1.6ml，加1mol/L乳酸钠0.4ml，然后加入PBS（pH7.4）至10ml。

（4）1％NP-40：取1ml NP-40加去离子水99ml。

（5）1mol/L枸橼酸终止液：取枸橼酸4.2g加去离子水200ml溶解。

（6）Tris-NH₄Cl溶液：NH₄Cl3.735g/450ml双蒸水＋Tris1.3g/50ml双蒸水（pH7.65）。

（7）靶细胞：YAC-1细胞株、小鼠NK细胞敏感株。

（8）效应细胞：小鼠脾细胞。

 

（1）靶细胞制备：取传代培养24～28小时对数生长期的YAC-1细胞，用RPMI-1640培养液洗涤2次1000r/min 离心5分钟。10％FCS-RPMI-1640培养液重悬细胞，并用0.5％台盼蓝染色检测细胞存活大于95%,调整细胞浓度至1×10⁵/ ml。

（2）效应细胞制备：将小鼠颈椎脱位处死，用酒精棉球消毒腹部，剪开腹部皮肤和腹膜，无菌取脾脏，出去脂肪膜等，放入加有约5ml PBS液的平皿中，用5ml 注射器抽取平皿内液体缓缓注入脾脏内，将脾细胞冲洗出来。如此反复冲洗，直到脾脏变白为止（约冲洗5～6次），将细胞移入离心管内，离心洗1次，1000r/min离心5～10分钟，重复洗1次，用10％FCS-RPMI-1640培养液重悬细胞，计数细胞，并调细胞浓度至1×10⁷ /ml。

（3）孵育：取效应细胞和靶细胞各0.1ml（E ：T＝100 :1）加入细胞培养板中，设3复孔，同时设靶细胞自然释放孔（0.1ml靶细胞＋0.1ml 10％FCS-RPMI-1640培养液）和zui大释放孔（0.1ml靶细胞＋0.1ml1％NP40液），1000r/min，低速离心2分钟。置37℃，5％CO₂孵育2小时。1000r/min，离心5分钟。

（4）测定：吸取各孔上清0.1ml加至新96孔板中，37℃，10分钟。每孔再加入0.1ml新配制的LDH底物溶液，室温避光反应10～15分钟。加入30µl 1mol/L枸橼酸终止液终止酶促反映。酶联监测仪在570nm波长下读各孔A值。

（5）计算：根据下列公式计算NK细胞活性：

免疫细胞是一组不均一的细胞群体。各种特定的细胞群其细胞表面表达有各自特异的表面标志分子，利用这些特异的表面标志，可以鉴定、分离和纯化相应的细胞群。随着单克隆抗体技术的诞生和免疫标记技术（特别是荧光标记技术）的发展，以及计算机科学的应用，使利用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为可能。本章介绍的荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，并结合光学检测和计算机分析技术而产生的鉴定和分离特定细胞亚群的技术。

    流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。根据测得的散射光（scattered light ）可得到细胞大小及颗粒状态的信息；而从荧光的发射强度（fluorescence emissions）则提供了结合在细胞上的抗体信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。

在流式细胞仪分离装置中，返回到计算机的信号，可用来产生一种电荷，这种电荷以特定准确的时间通过FACS的吸管孔，在与吸管孔的液体流相相遇时，可将液体流打碎成只含一个细胞的微滴。含有电荷的微滴就会从主液体流中偏移，穿过一双极板。带正电荷的微滴被吸引至阴极，而带负电荷的被吸引至阳极。以这种方式，特定的细胞亚群由于标记着不同的荧光抗体而带有不同的电荷，从而将目的细胞从混合的细胞群中分拣出来。

流式细胞仪主要有两个zui基本的用途：*是可以定量分析鉴定活细胞表面表达的特异分子，第二是进行特定的活细胞群的分离和纯化。

1.            免疫细胞群的分类 静止淋巴细胞之间从其外观形态难以区分，都是以致密的核及少量细胞质组成的小而圆的细胞为特征。然而，这些细胞确是由功能各异的不同细胞亚群所组成，各种细胞群表达各自特殊的表面分子。例如,B淋巴细胞上表达有特异的膜表面免疫球蛋白（mIg），而成熟的T淋巴细胞表面表达特异的CD3分子。T淋巴细胞又可进一步按其表达的不同表面标志细分成不同的亚群，如CD4+CD8-和CD4-CD8+亚群。因此，可由这些特征性的表面标志，将细胞分为不同的群或亚群。

2.           免疫细胞的分化发育 免疫细胞分化发育的不同阶段，其表面标志也在不断地发生着变化。如胸腺细胞（发育过程中的T淋巴细胞），在发育的不同阶段从不成熟到成熟，其表面标志经历了从双阴性（CD4-CD8-）到双阳性（CD4-CD8-），直到单阳性（CD4+CD8-或CD4-CD8+）的过程。正常生理状态下，发育不同阶段的胸腺细胞以一定的比例存在于胸腺中。通过检测这些标志，即可判定某些因素（基因突变等）对胸腺细胞发育的影响。

3.           免疫细胞的分子表达 免疫细胞的不同因素的影响下，其表达的分子也会发生变化。通过检测这些分子的变化，可分析细胞功能以及细胞分化状态等。例如，静止的T淋巴细胞不表达或低水平表达CD69分子；而一经活化，其表达CD69分子数量明显增加。因此，可通过检测这些活化标志的变化来判定细胞状态以及研究影响细胞活化状态的因素。

4.           免疫细胞的分离 如前所述，免疫细胞是一组极不均一的群体。所以在研究免疫细胞功能时，常常需要把某些特异的细胞分离和纯化。虽然免疫细胞分离的方法很多，但用FACS来纯化特定的细胞群是目前zui为有效和方便的手段。例如，zui近颇受关注的CD4+CD25+T淋巴细胞是一群具有免疫调节（免疫抑制）功能的细胞群。在对其特点及功能进行研究时，首要的问题是分离该细胞群。用相应的单克隆抗体与其结合，再用FACS进行分离，就能得到纯度很高CD4+CD25+T淋巴细胞细胞群。而其他分离方法不仅分离过程烦琐，也很难控制无菌条件及保证细胞纯度。

流式细胞仪的使用一般分为三个步骤。*，是仪器前阶段，包括试剂的准备，细胞制备、细胞的荧光染色；第二，是流式细胞仪阶段，主要是仪器的操作；第三，是结果分析阶段。

（1）细胞样品：来源淋巴细胞或外周血的白细胞。

（2）荧光标记单克隆抗体：常用的有FITC（fluorescein -isothiocyanate）和PE（phycoerythrin）标记的单克隆抗体。

（3）封闭抗体：抗Fc受体抗体

 免疫细胞表面一般表达有Fc 受体，能和抗体的Fc段结合。封闭抗体的作用就是阻断荧光标记的单克隆抗体的Fc段与免疫细胞表面Fc受体结合所产生的非特异性的结果。

（1）       FACS缓冲液：

          1×PBS         950ml

          10%叠氮钠溶液 10ml

（2）       仪器缓冲液（FACS-flow）：仪器厂家提供

（3）       FACS清洁液（FACS clean ）和FACS洗净液（FACS rinse）：仪器厂家提供。

（1）             单细胞悬液的制备：将1×10⁵~1×10⁷的细胞放入1.5ml离心管中3000r/min离心5分钟，弃上清；加入FACS缓冲液100μl悬浮细胞。

（2）             封闭细胞表面Fc受体：在步骤1中加入Fc受体抗体0.5μl（0.5mg/ml），水浴3分钟。

（3）             细胞与荧光抗体结合：在步骤2中加入荧光抗体1μl（0.5mg/ml），水浴30分钟。

（4）             洗细胞去除游离的荧光抗体：在步骤3中加入FACS缓冲液350μl，轻轻混匀，3000r/min，离心5分钟，弃上清，重复步骤（4）2次。

（5）             上样前处理：取100μl仪器缓冲液加入步骤（4）获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞，将细胞悬液移入FACS管中，准备进行仪器检测和分析。

以FACSCaliburTM（BD Biosciences）仪器为例。仪器主要分为主机部分（包括激光激活源，射流，射线探测器）和计算机部分（CELLQuest softwere）。仪器的操作分为使用前的准备、使用中的操作和使用后的清洗。

1.使用前的准备

（1）打开电源：包括系统电源和主机部分电源。

（2）检查供液槽和废液槽：供液槽应含足够的仪器缓冲液，废液槽应在上次使用后清洗干净。

（3）使机器处于负亚状态，才能使细胞悬液被吸入至机器的吸管口。

（4）机器处于可应用状态时，指示灯会变成绿色。

2.使用中的操作

（1）       计算机部分——使用CELLQuest程序系统软件：

设定所要检测细胞的数量：一般设10 000~20 000个细胞。

命名本次实验：一般含使用者的姓名和实验日期。

打开记数部分：显示进入的细胞数以及检测一定量的细胞所需要的时间。

将微机与主机连接：控制检测时的预检测和实际检测。

主机设定：一般是已设定好的适合测定淋巴细胞的条件，包括探测器的电压。探测器的电压是调空光电倍增管所能检测荧光密度的范围。

选择检测的波长和表达方式（plot）：如果用一种荧光抗体，一般选直方图（histogram）（表11-1）：如果用两种荧光抗体，常选点状二维图（dot plot）或轮廓线图（contour plot）表

 

 

不同的荧光物要求选择不同的激发波长，参见下表

（2）细胞的吸入：将装有细胞的FACS测定管放置到机器吸管孔处。

先预检测样品，然后进行实际检测。可根据细胞的浓度选择测定的速度（低、中或高）。所有的数据将自动存入微机。

3.使用后的清洗 所有样品测定完后，要进行仪器的清洗。

（1）将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入1分钟。

（2）将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入 1分钟。

（3）再将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5分钟。

（4）同样再将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入5分钟。

（5）zui后将一装有双蒸水的FACS管放置机器吸管孔后，关闭机器。

（6）将废液槽中的废液倒掉，并清洗干净废液槽。

（一）小鼠胸腺细胞CD4及CD8分子表达的检测

a .简要说明

（1）细胞为小鼠胸腺细胞。

（2）抗体为PE标记的抗CD4抗体和FITC标记的抗CD8抗体。

b.结果 以点状二维图（ dot plot）表示，见表11-2。横坐标为CD8分子，纵坐标为CD4分子。所以右上代表双阳性细胞群，左下代表双阴性细胞群，左上代表CD4+CD8-的单阳性细胞群，右下代表CD4-CD8+单阳性细胞群。

c.结果分析 胸腺中存在着发育不同阶段的胸腺细胞，这些发育不同阶段的胸腺细胞表达CD4及CD8分子存在着差异。上面的结果是正常小鼠胸腺细胞CD4及CD8分子的表达情况：①存在着4种亚群：CD4-CD8-的双阴性细胞群（5.6%），CD4+CD8+的双阳性细胞群（74.3%），CD4+CD8-的单阳性细胞群（16.1%）和CD4-CD8+的单阳性细胞群（4.0%）；②在这4种亚群中以CD4+CD8+的双阳性细胞群为主（75%）。

（二）小鼠脾细胞中T细胞和B细胞的组成

1. 简要说明

（1）             细胞为小鼠脾细胞

（2）             抗体为PE标记的抗CD3抗体和FITC标记的抗CD45R抗体

2. 结果 以点状二维图表示，见表11-4。横坐标为B220分子，纵坐标为CD3分子。因此，左上为T细胞群，右下为B细胞群。

3. 结果分析 在脾脏中主要存在有两大类淋巴细胞群——T细胞和B细胞。其中B细胞占60%左右，T细胞占30%。

（三）活化T细胞CD69分子的表达

1.简要说明

（1）             成熟T细胞来自正常小鼠脾脏，经纯化而获得，通常情况下T细胞处于静止状态，而在不同浓度的抗CD3抗体的刺激下T细胞活化。

（2）             抗体为FITC标记的抗CD69抗体。

2. 结果 以直方图表示，参见表11-1。横坐标为荧光的强度，纵坐标为具有相应荧光强度的细胞数。

3. 结果分析 在没有抗CD3抗体刺激时，绝大多数处于静止状态的T细胞不表达CD69分子（CD69+0.3%）；在2μg/ml抗 CD3抗体刺激下，42.4%的 T细胞表达CD69分子；在10μg/ml抗CD3抗体刺激下，54.3%的T细胞表达CD69分子。说明静止的T细胞不表达或表达较少的CD69分子，而活化的T细胞则表达高水平的CD69分子，并且该分子的表达随着活化的强度而增加。因此，检测CD69分子可作为T细胞活化的标志。

（1）减少非特异荧光染色

细胞的活性和状态：流式细胞仪不但可探测细胞表面的荧光，也可探测细胞内的荧光。因此，如果要检测细胞表面的分子，一定要保证细胞的活性，还应尽可能保持细胞静止，通常在4度进行操作。否则，荧光抗体进入死细胞内，会产生非特异结果。

封闭抗体的应用是*的，因为大多数的免疫细胞表面都表达有Fc-R。细胞与抗体相互作用后，一定要用FACS缓冲液洗2~3次，以除去游离的抗体。

（2）单染色时以FACSzui常用，FITC标记抗体荧光比较稳定而且价格合适。

（3）如果同时要检测两种以上的分子，一定要选择不同波长的荧光所标记的抗体。

杀伤功能是机体免疫功能的一个重要方面，免疫系统中有多种具有杀伤功能的靶细胞，如自然杀伤细胞（NK）、细胞毒性T细胞（CTL）、具有ADCC作用的单核细胞巨噬细胞等。在体外，多种细胞因子（如IL-2）可明显促进某些效应细胞的杀伤功能（如LAK），此外，通过识别靶细胞某些膜分子的抗体可介导重导向杀伤功能。本章主要介绍NK、LAK和重导向杀伤试验。由于混合淋巴细胞培养（MLC）可诱导出NK、CTL和LAK靶细胞，因此在本章一并介绍。

NK细胞存在于人或动物外周血、脾脏、淋巴结和骨髓中，能杀伤某些肿瘤细胞、病毒感染靶细胞，无需抗原或有丝分裂原刺激，也不依赖抗体或补体，在机体杀伤肿瘤、防御感染及免疫调节中发挥重要作用。

LAK是NK或T细胞在体外高剂量IL-2诱导下，获得能杀伤NK抵抗的肿瘤细胞的功能，在过继免疫治疗肿瘤中已得到广泛的应用。

通过将同位素⁵¹Cr掺入到NK的靶细胞K562（红白细胞白血病细胞）或LAK的靶细胞Libr（黑色素瘤细胞），按一定细胞比例与效应细胞（NK或LAK）孵育4小时，根据细胞上清中靶细胞被杀伤后所释放的⁵¹Cr水平计算出杀伤细胞的杀伤活性。

1. 细胞系：K562、LiBr

2. 10%FCS RPMI 1640

3．rHu IL-2

4. ³H-TdR、⁵¹Cr

5．培养瓶、培养板、CO₂孵箱、离心机

6．β-液闪仪、γ-计数仪

1．      效应细胞的制备

NK功能效应细胞可取静止的PBMC，或经不同细胞因子诱导的PBMC。

LAK功能的效应细胞通常将PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或体液（癌性胸腺水）中分离的淋巴细胞（110⁶/ml）在含有高剂量IL-2（200~1000ul/ml）的10%FCS RPMI 1640诱导2~5d而成。

2．      杀伤试验

 主要有⁵¹Cr4h释放法和³H-TdR释放法，前者操作时间短，非常敏感；后者需要无菌操作，所需时间较长。

（1）       ⁵¹Cr4h释放试验：

①收获处于对数生长期的靶细胞（K562、LiBr等），洗涤后调整细胞浓度为2×10⁶/ml

②取1×10⁶细胞（0.5ml），加Na₂⁵¹CrO₄ 100uCi,37度孵育2~3h，每15min轻轻振摇一次。

③用10%FCS RPMI 1640洗涤3次，每次800rpm、5min。

④重悬细胞浓度1×10⁵/ml。

⑤96孔v型或U型培养板中，每孔加100ul（1×10⁴细胞），设3个复孔。

⑥每孔加入100ul不同细胞浓度的效应细胞，zui大释放组加入100ul1%Triton X-100；自然释放组加100ul*培养基。

⑦200g离心1min。

⑧37度、CO₂孵箱培养4h。

⑨200g离心1min。

⑩每孔取出100ul上清，β计数仪测定值。

计算：特异性杀伤率（%）=（实验组cpm-自然释放cpm）/（对照组-自然释放cpm）

（2）             ³H-TdR释放试验

 ①收获处于对数生长期的靶细胞（K562、LiBr等），洗涤后调整细胞浓度为2×10⁶/ml，加³H-TdR 20uCi。

②7度孵育2~3h。

③用10%FCS RPMI 1640洗涤3次，每次800rpm、5min，调整浓度为1×10⁵/ml。

④96孔U型或平底培养板中，每孔加100ul（1×10⁴细胞），设3个复孔。

⑤每孔加入100ul不同细胞浓度的效应细胞，zui大释放组加入100ul1%Triton X-100；自然释放组加100ul*培养基。

⑥CO₂孵箱培养18~24h。

⑦每孔取出100ul上清，加入胰蛋白酶（终浓度0.15%）和DNA酶（终浓度为0.0125%）

⑧继续孵育30min。

⑨用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上。

⑩烤干后，β计数仪测定值。

计算：特异性杀伤率（%）=（1-实验组cpm/对照组cpm）×100%

   1．每次试验取3~4个不同的效应细胞/靶细胞比例，常用效靶比例为100：1、50：1、25：1、12.5：1。

       2．诱导LAK细胞过程中要注意无菌操作。

       3．避免同位素污染。

       根据实验需要，可采用纯化的NK细胞作为效应细胞，常用Percoll不连续密度梯度离心纯化NK细胞（见表）。

     1个溶解单位（Lytic unit,LU）为一定效应细胞30%溶解（杀伤）5×10³/靶细胞（K562）的水平。

如需进一步纯化LGL，可通过除去具有高亲和性羊红细胞受体细胞（T细胞），因为NK细胞只具有低亲和性的绵羊红细胞受体（ER）。具体方法是将Percoll分离的位于第2、3梯度间的细胞洗涤后，调整细胞浓度为5×10⁶/ml，移入试管，加入2mlFCS和2ml 1×10⁸/ml SRBC，100g离心5min，29度孵育1h，轻轻重悬细胞，叠加于3mlFicoll上，400ug室温下离心30min，界面不形成花环的细胞即为LGL，纯度可大于90%。

在用PBMC作为效应细胞进行NK活性测定时，如想除去PBMC悬液中混杂的红细胞，可用蒸馏水低渗的方法除去红细胞，而不用N H₄Cl方法，因为后者可降低NK功能。

在小鼠NK实验中必须注意小鼠的品系和周龄。

    三周内或3月龄以上小鼠的NK水平一般很低。

混合淋巴细胞培养（MLC）或称混合淋巴细胞反应（MLR）以往为用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原（HLA抗原）相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化，因此MLC又是免疫调节研究中常用的实验模型。

    原理

两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLAⅡ类抗原不同，可相互刺激对方的T细胞发生增殖，此外双向混合淋巴细胞培养（two way MLC）；若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂酶C处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养（one way MLC）。两个个体间HLA抗原差异程度越大，反应越强烈，可通过细胞数量、形态检查或³H-TdR掺入率检测反应细胞的增殖水平。EB病毒转化的B淋巴细胞表达高水平的HLAⅡ类抗原，常作为单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞。

    1．细胞：刺激细胞N23细胞系，反应细胞：外周血单个核细胞。

    2．10%FCS RPMI 1640培养基。

    3．照射源：⁶⁰Co装置

    4．细胞培养瓶、培养板、滴管、吸管等。

    5．CO₂孵箱、超净台。

    1．刺激细胞的准备：常用的刺激细胞有EB病毒转化的B淋巴细胞（如N23细胞）或PBMC。取处于对数生长期的N23细胞，离心后重悬于新鲜*培养基中，调整细胞数为1×10⁶/ml~2×10⁶/ml，移置于塑料培养瓶或者50ml离心管中，用⁶⁰Co照射3000rad。

    2．反应细胞的准备：分离纯化待检个体的PBMC。

    3． LC：按2×10⁶PBMC与1×10⁵经3000rad照射的N23细胞的比例，重悬于4ml10%FCS RPMI 1640,放置于小培养瓶中进行MLC，培养瓶保持直立，培养4d内不要晃动，第5d加入1ml新鲜培养基。如要测定³H-TdR掺入率，一般可在MLC的第5d进行；如要检测MLC中NK、LAK或特异性杀伤性T淋巴细胞（CTL），一般在7~10 d左右收获效应细胞。杀伤细胞功能检测参见本章“自然伤细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞的杀伤功能”，所不同的是CTL的靶细胞选用作为刺激细胞的N23细胞。

    1．注意无菌操作

    2．刺激细胞接受照射剂量要准确，是细胞暂时存活，但失去增殖的能力。

    3．可用RAJI或Daudi细胞作为刺激细胞，也可将不同的细胞混合作为刺激细胞。不同刺激细胞与反应细胞的合适比例有所不同，应做预实验选择*的实验条件。

试剂与材料 2g/L NBT盐水（室温搅拌1小时或80度水浴中搅拌溶解，滤纸过滤，4度保存有效期3~6个月），用时与Ph7.2 0.15mol/L PBS等量混合，即为工作液。肝素、甲醇溶液、10g/L沙黄水溶液、小试管、毛细滴管、玻片、温箱以及显微镜等。

试验步骤 采用硝基蓝四氮唑还原试验。

（1）       试管法：

 

肝素抗凝血0.1ml滴于小试管底部，再加入等量NBT应用液

 

37度，30分钟（中间摇动一次），再置室温15分钟

 

摇匀，用毛细管取一滴放于玻片一端，做血涂片

 

立即用电吹风吹干，甲醇溶液固定1分钟，10g/L沙黄水溶液染色5分钟

 

PBS冲洗、自然干燥、油镜检测

 

 

 

 

 

 

（2）微量法：

 

取硅油处理的1mm×75mm的毛细管取末梢血至30mm处

 

立即吹入硅油处理的凹玻片中，与1/30量的0.05%肝素溶液混合

 

加等量的1g/L NBT，轻轻摇动混合，湿盒内，37度，室温15分钟

 

用毛细管吸去表层上清液，用硅油处理的毛细管吹数次混匀

 

吸出少许制成血片，空气干燥，沙黄水溶液染色，油镜观察

 

试验结果 血片中有10%以上的中性粒细胞的胞质中有蓝紫或蓝黑颗粒沉着，其沉着颗粒形状大小不一，有的呈大块状，有的呈点状或放射状。

关键问题 NBT配制一定要*溶解，滤液要呈透明的淡黄色，储存于棕色瓶中，NBT应用液应于用前配制。血涂片要求推出尾部，不可过厚或过薄。血液与NBT要充分混合，保温时间不能过长。

 

昆明种小鼠（体重18－22g）、用生理盐水配制的10g/L淀粉溶液、2％鸡红细胞、肝素注射液、瑞士－姬姆萨染液、注射器、毛细管、解剖用具。

 

小鼠腹腔注射10g/L淀粉溶液2ml

              ↓

 24h后，小鼠腹腔注射2％鸡红细胞1ml

↓

30min后，小鼠脱臼处死，腹腔内注射0.2ml肝素注射液，揉动腹部

              ↓

毛细管吸取腹腔液，滴一滴于玻片上，将毛细管平放于液滴上展开液滴，自然干燥

               ↓

瑞士－姬姆萨染液染色5min，pH7.2PBS浸泡5－6min自然干燥后，油镜观察

 

结果判定 观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况，计数200个局势细胞，以及其中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数，计算吞噬百分率。

 （1）斑蟊浸液制备：斑蟊以95％乙醇溶液制成10％酊剂，室温下浸泡2周后使用。

 （2）人巨噬细胞的获取：取滤纸片蘸斑蟊酊，置于一侧前臂皮肤上，在滤纸片上盖一塑料片，再以清洁纱布固定4～5小时，取下滤纸片，再用塑料瓶盖将局部罩上，以防形成的水疱破裂，48小时即可形成完整的水疱。

         取水疱渗出液0.5ml，加5％鸡红细胞悬液0.01ml

                            ↓

       混匀，置37℃水浴30分钟（每10分钟轻轻摇晃一次）

                            ↓

1000r/ min离心5分钟，弃上清，留少许液体混匀细胞，涂片

                        ↓

     用甲醇溶液固定后，用瑞士－姬姆萨染色，油镜观察

关键点 细胞涂片要轻，以免推破巨噬细胞。涂片不可过厚或过薄，以免影响观察结果。

    斑蟊酊剂皮肤炎性渗出液大多再1～ml，zui多的可达6ml，渗出液中所含巨噬细胞平均为30％～40%，zui多可达80％。抽取水疱液时，将皮肤消毒后，用无菌注射器抽取，盛于无菌试管中；局部敷以无菌纱布，24小时后取下纱布。用此方法病人无痛苦及不良反应。

实验十 细胞因子活性检测

检测细胞因子对阐明机体免疫应答及其调节机制、免疫相关疾病的发生、发展规律和知道临床治疗均具有重要意义。细胞因子的检测主要分为免疫学、生物学和分子生物学三种检测方法。免疫学方法主要采用双位点ELISA法定量检测细胞因子，分子生物学方法主要检测细胞因子mRNA表达水平。本部分只介绍生物学方法检测细胞因子活性，其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株（即靶细胞）的促增殖作用，以增殖细胞中的DNA合成或酶活性为指标，间接推算出细胞因子的生物学活性单位。

白细胞介素-1（IL-1）主要是由活化的单核-巨噬细胞合成和分泌的一种细胞因子，具有活化淋巴细胞、协同刺激胸腺细胞增殖、参与抗体产生和促炎症反应等多种生物学功能。IL-1有IL-1α和IL-1β构成，结合同种受体，表现相同的生物学活性。用于检测IL-1生物活性的方法有多种，如小鼠胸腺细胞增殖法、D10G4.1细胞增殖法、EL-4细胞测定法等。

IL-1与小鼠胸腺细胞共同培养时，IL-1可刺激小鼠胸腺细胞增殖。进一步通过³H-TdR掺入法或染料摄入法判定小鼠胸腺细胞增殖量，推定IL-1的生物学活性。通过检测IL-1的生物学活性，可了解单核-巨噬细胞等的功能。

（1）10%FCS-RPMI-1640培养液。

    （2）LPS 用10% FCS-RPMI-1640配制10ug/ml。

    （3）刀豆蛋白A（ConA） 用10% FCS-RPMI-1640配制2.5ug/ml。

    （4）³H-TdR

    （5）C57BL小鼠，6~10周龄，雌雄均可。

    （1）小鼠巨噬细胞产生IL-1的诱导

     ①常规收集小鼠腹腔巨噬细胞，10%FCS-IMDM培养液悬浮细胞2×10⁶/ml，接种于24孔培养板，0.5ml/well。

     每孔加20ug/ml LPS0.15ml，37度，5%CO₂孵育36~48小时。

     ③此时培养上清内含巨噬细胞分泌的高水平IL-1，收集培养上清，12000r/min离心15分钟，将上清移入新的1.5ml试管中，-20度冻存。

    （2）IL-1的生物学活性测定

     ①胸腺细胞的制备：颈椎脱位处死小鼠，无菌取胸腺至于平皿中，加入5ml10%FCS-IMDM培养液，200目不锈钢网制成单个细胞悬液；1500r/min离心10分钟，再用5%Hank’s液洗涤细胞2次后，重悬于10%FCS-IMDM培养液中，调细胞浓度为1.0×10⁷/ml。

     ②加样：取胸腺细胞加入96孔细胞培养板，0.1ml/well。再加入IL-1待测样品或IL-1标准品，50ul/well，实验孔再加入50ul ConA（终浓度0.625ug/ml），同时设培养液对照孔（0.1ml细胞+0.1ml培养液）、ConA对照（0.1ml细胞+50ul培养液+50ul ConA），均设3复孔。37度，5% CO₂孵育36~60小时。

     ③³H掺入：每孔加1.85×10¹⁰uBq/20ul（0.5uCi/20ul）³H-TdR，继续培养8小时。

     ④测定：多孔细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤纸上，用β液体闪烁仪测定³H-TdR

掺入量（cpm）以净cpm值（实验孔- ConA对照孔cpm值）为纵坐标，对应的不同稀释浓度IL-1标准品为横坐标，在半对数图纸上绘制出标准曲线，再从标准曲线上查出待测样品中的IL-1含量。

    （1）吸取LPS刺激的小鼠巨噬细胞培养上清时，必须离心，以除去细胞及细胞破碎成分。

    （2）ConA应选择淋巴细胞转化实验的亚剂量，即选择能够激活胸腺细胞，又不引起明显增殖的量，如果ConA过量，则不能有效反应IL-1的刺激活性。

白细胞介素-2（IL-2）是由活化的辅助性T细胞分泌的一种细胞增殖因子，具有促T细胞增殖和维持T细胞体外长期生长的作用。CTLL-2为IL-2依赖细胞株可用作IL-2生物学活性定量检测。本实验采用MTT分析法，通过测定CTLL-2细胞的增殖量，确定IL-2生物学活性单位。检测IL-2的生物学活性，可以间接了解辅助性T细胞的功能。

   （1）1）10%FCS-RPMI-1640培养液，含2mmol/L谷氨酰胺、25mmol/LHEPES、10U/ml青霉素、100ug/ml链霉素。

   （2）MTT（4，5-dimethythiazoyl-zyl2,5-diphenylterrajolium bromiole）用PBSA缓冲液配制成1mg/ml浓度工作液，4度避光保存。

   （3）IL-2标准品。

   （4）PHA（200ug/ml）。

   （1）人外周血T细胞分泌IL-2的诱生：

    ①人PBMC分离：采用常规淋巴细胞分层液浓度梯度离心法分离PBMC，用10%FCS-RPMI-1640培养液调整细胞浓度为

加样：接种细胞悬液于24孔培养板，每孔0.5lml，每孔再加PHA0.5ml，37度，5% CO₂孵育48小时。

    ③回收上清：吸出细胞培养上清，12000r/min离心15分钟，收集上清，-20度冻存。

   （2）IL-2生物活性测定

    ①CTLL-2细胞制备：取传代培养24~48小时对数生长期的CTLL-2细胞，用培养液离心洗涤2次，每次1000r/min离心5分钟，再用10%FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1×10⁵/ml。

    ②加样：将细胞接种于96孔培养板，每孔0.1ml。同时将待测样品和标准品做倍比稀释，每孔加入0.1ml，每个稀释浓度均设3复孔。另设培养液对照孔（100ul细胞+100ul培养液）。37度，5% CO₂孵育40小时。

    ③MTT掺入：轻轻吸取上清液100ul，加MTT（1mg/ml）100ul，37度，5% CO₂孵育2小时。

    ④测定：离心培养板，2000r/min，5分钟，吸弃上清液，每孔加100ulDMSO，作用30分钟，用酶标测定仪于波长570nm测吸光值（A）。

    ⑤计算：用标准品浓度和对应的净A_570nm值（实验孔-阴性对照孔的A_570nm值）绘制标准曲线。根据标准曲线求出待测样品IL-2水平。

   （1）CTLL-2细胞存活率应大于95%。

   （2）因标本中含IL-4等，可影响IL-2的测定，采用抗IL-4mAb吸附剂除去IL-4。

IL-4主要是由T_H细胞活化后产生的一种细胞因子。CT.4S细胞为IL-4的依赖细胞株，对IL-2呈现低反应性，其增殖反应与IL-4的活性呈正相关系。检测IL-4的生物学活性水平，可间接了解T_H2细胞及与抗体介导的一些体液免疫的功能。

 

试剂与材料 CT.4S细胞株，A23187（钙离子载体）（用生理盐水配制成0.1ug/ml浓度）。其他同IL-2测定。

   （1）IL-4诱生

    ①人PBMC分离：淋巴细胞分层液常规分离PBMC，用10%FCS-IMDM培养液调细胞浓度为1×10⁶/ml。

    ②加样：将细胞接种于24孔细胞培养板，每孔0.5ml。再分别加0.25mlPHA（200ug/ml）和0.223187（0.2ug/ml），37度，5% CO₂孵育24小时。

    ③回收上清：将细胞培养板1500r/min离心10分钟，收集细胞培养上清液，-30度冻存。

   （2）IL-4生物学活性测定

        CT.4S细胞悬液制备       ①

         接种细胞于96孔培养板     ②

        加待测样品和标准品          ③

加³H-TdR         ④

    收集细胞，测定³H-TdR掺入量        ⑤

绘制标准曲线，计算待测样品的IL-4的活性单位         ⑥

 

①用0.25%胰酶消化、收集生长旺盛的贴壁CT.4S细胞；经Hank’s液离心洗涤2次后，10%FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1×10⁵/ml。

    ②接种细胞于96孔细胞培养板，每孔0.1ml。

　　③加入适当稀释的待测样品和标准品，每孔０.１ml。每个样品设３个复孔，同时设培养液对照。37度，5% CO₂孵育４８小时。

　　④与⑤同IL-2。

⑥以cpm为纵坐标，对应的不同稀释浓度IL-4标准品浓度为横坐标，在半对数图纸上绘制出标准曲线，再从标准曲线上查出待测样品中的IL-4含量。

   关键点 在IL-4诱生过程中，常同时产生一定量的IL-2，将影响IL-4的检测结果。因此，采用IL-2mAb吸附剂除去IL-2。

MH60.BSF2为IL-6依赖细胞株，MH60.BSF2细胞增殖量同IL-6的生物学活性呈正相比。

试剂与材料 同IL-2的生物学活性检测。

   （1）IL-6的诱生：诱生过程与IL-2基本相同。用于诱导产生IL-6的细胞可用PBMC。诱生剂用PHA。

   （2）IL-6的生物学活性测定：采用MH60.BSF2细胞增殖法，测定过程IL-2。应用的MH60.BSF2细胞浓度为2×10⁵/ml。

IL-8中对中性粒细胞具有激活和趋化作用，通过检测中性粒细胞的迁移距离可以确定IL-8的生物学活性，即对中性粒细胞的趋化活性。

（1）       6%右旋糖酐生理盐水溶液。

（2）       淋巴细胞分层液比重为1.077+（-）0.001。

（3）       2%琼脂糖：称取2g琼脂糖，加入到100ml蒸馏水中，煮沸溶解。

（4）       0.1%白明胶Hank’s液。

（5）       DMEM培养液（2×浓缩），内含20%FCS和0.75mg/mlNa₂CO₃溶液。

（6）       甲醇溶液、Wright-Giemsa染液。

（7）       洁净载玻片。

（8）       打孔器，直径为3mm。

    （1）IL-8的诱生

①     常规分离PBMC，洗涤后，调细胞浓度为5×10⁶/ml。

②     将细胞接种于24孔细胞培养板，每孔0.5ml。

③     加诱生剂LPS（20ug/ml），每孔0.5ml，37度，5% CO₂孵育48h。

④     离心收集细胞培养上清液，用HCl溶液调为酸性（PH4.0），经SephadxG-75柱分离，收集活性组分即为待测的IL-8粗品。

（2）IL-8的生物活性检测

①琼脂板的制备；取溶化后50度左右保温的2%琼脂糖与等体积50度水浴预温的DMEM培养液（2×浓缩），混合，取3ml加到洁净的载玻片上，铺成薄层，室温凝固后，放4度，进一步凝固30~60分钟，红打孔器打孔。

②         中性粒细胞制备：常规分离人外周血中性粒细胞。

③         加样：取10ul中性粒细胞悬液加入琼脂板各组中心孔，分别取10ul待检样品及阳性对照品加入样品孔，取10ulDMEM培养液加入对照孔；将玻片置于湿盒内，37度温育2小时。

④染色：用甲醇溶液固定30分钟，用瑞氏染液染片并干燥。

⑤检测：显微镜下分别测量细胞从中心孔向样品孔游走的距离（趋化游走距离）及向阳性对照孔的游走距离（自发游走距离），趋化 活性以趋化指数表示。

      趋化指数=趋化游走距离/自发游走距离

     关键点 为确认待检样品中IL-8的特异性趋化效应，同时比较抗IL-8抗体与待测样品作用后的趋化结果。

在小鼠IL-4（Mil-4）存在的情况下，IL-10可刺激D36小鼠肥大细胞株增殖。而单一的m IL4或h IL-10则仅有很低的增殖刺激活性。

（1）20%FCS-IMDM培养液，含8U/ml的rm 里减四。

   （2）rh IL-10标准品。

   （3）³H-TdR。

   （4）D36小鼠肥大细胞株。

          D36细胞悬液制备           ①   

          接种细胞于96孔培养板     ②

          加待测样品和标准品        ③

          加³H-TdR                 ④

          收集细胞，测定³H-TdR掺入量     ⑤

          绘制标准曲线，计算待测样品的IL-10的活性单位    ⑥

   ①取生长旺盛的D36细胞用IMDM培养液洗涤2次，悬于20%FCS-IMDM培养液，并调制浓度为2×10⁴/ml。

   ②~ ⑥参考IL-4测定。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1．10%NaHCO₃溶液：

 取NaHCO₃  10克加蒸馏水100毫升，高压灭菌1.5磅/10分钟

即可使用

2．Hanks液：

原液甲 NaCl 160 克

       KCl    8克

       MgSO₄7H₂O 2克

       MgCl₂6H₂O 2 克

按顺序溶于800毫升双蒸馏水

      CaCl₂   2克

溶于100毫升双蒸馏水中

两液混合加双蒸馏水1000毫升，再加入2毫升氯仿做防腐剂。盖紧瓶塞。保存于4℃

原液乙 Na₂HPO₄12H₂O   304克

        KH₂PO₄                1.2克

        葡萄糖        20克

按顺序溶于800毫升双蒸馏水

0.4%酚红溶液   100毫升

将酚红液加到上述溶液中，加双蒸馏水1000毫升，再加入2毫升氯仿做防腐剂。盖紧瓶塞。保存于4℃

用时按原液甲    1份

      原液乙    1份

      双蒸馏水 1份

于10磅10分钟高压灭菌，4℃保存一个月。用前用5.6%碳酸氢钠调PH7.2—7.4，根据需要加青链霉素。

3．阿氏液 用于保存红细胞

 葡萄糖（A*R级） 2.05克

 柠檬酸钠   2水 0.8克

氯化钠   0.42克

无离子水或双蒸馏水100毫升

高压灭菌8磅20分钟，置于4℃冰箱内保存备用

4．小牛血清 （FCS）

购得的小牛血清必须先经过56℃，30分钟灭活后才可使用。应分装小瓶冰冻保藏，长期备用。

5.吸收过的胎牛血清

除去胎牛血清中对绵羊红细胞的嗜异性抗体，可取经56℃30分钟加热灭活的小牛血清，加半量压积绵羊红细胞，混合后，37℃水浴20分钟。水浴后，2000转每分钟，10分钟。吸取上清液即成。

6．肝素溶液

将注射用的肝素（每支含12500单位）。用无菌生理盐水稀释成250单位每毫升。放4℃保存，使用时取2滴（约含25单位）可抗凝1毫升全血。

7．1%硫柳汞

硫柳汞   1克 

 丙酮 10毫升

乙醇    50毫升

溶解后加蒸馏水至100毫升

8．玻璃器皿清洗液

稀浓度：重铬酸钾 50克

        自来水 850毫升

        浓硫酸 100毫升

浓浓度：重铬酸钾 4克

        自来水 160毫升

        浓硫酸 800毫升

重铬酸钾加匀后加热搅拌溶解，冷却（不能让重铬酸钾结晶析出）倒入教大的器皿（瓷钵等）内将器皿放入冷水中。再将浓硫酸缓慢加入，边加边搅拌，zui初加的100—200毫升浓硫酸要求特别慢，待全部浓硫酸加完后，配好的洗液应呈酱色，无红色结晶物析出。

9．1N NaOH溶液

称取化学纯NaOH 40克 溶于1000毫升蒸馏水中。

10．1N HCl溶液

取比重为1.19的盐酸8.3毫升，加蒸馏水稀释成1000毫升。

11.瑞氏液

称取瑞氏染粉0.1克，溶于60毫升甲醇中，过滤，贮存于棕色试剂瓶中。保存半年以上染色效果好。

12.吕氏碱性美蓝染液

溶液A 美蓝    0.6克

95%乙醇 30毫升

溶液B氢氧化钾 0.01克

蒸馏水 100毫升

分别配制溶液A和B 配好后混合即可。

1.家兔心脏穿刺采血法：

一个人固定兔子用两腿夹住兔子的两条后腿，两手握住两前腿，使家兔前胸尽量向前突。用剪刀去左前胸的毛，以碘酒消毒，再用酒精棉球擦去碘酒。

先用手指按摸心脏搏动zui强部位（约在左侧胸骨的第三肋间）将针头刺入，如已刺入心脏则可见针头随心脏搏动而上下跳动，此时轻轻抽动注射器，可见血液涌出。一般家兔抽取30—50毫升仍可生存，如不需保存动物可抽取80—120毫升。

2.家兔颈动脉放血法

将家兔仰卧固定，使头部后仰，整个颈部伸直露出，用消毒液擦拭，除颈部外的其它部位用消毒湿纱布覆盖起来将颈下皮肤纵向切开，剥离皮下组织，分离肉与气管，在颈静脉下可见迷走神经平行强烈搏动的动脉血管。将血管周围的结缔组织分离后，用止血钳夹死上下两端，在两钳中间切断血管，再用镊子夹住心端，然后在钳子和镊子中间的血管壁上斜开小口，放入采血瓶中松动镊子，血液便可留入瓶中。放血速度可由镊子掌握，以免过快发生溶血。（此法可 用于豚鼠的全采血，也可用于牛马羊等大动物）

3.家兔耳静脉采血法：

轻弹兔耳，再用75%酒精深擦，使其充血和消毒，然后刺破静脉，用注射器轻轻抽取血液。

4.血液分离方法

分离血清通常心脏采血，也可由颈动脉放血。

方法：

1．将抽的血收集在无菌三角烧瓶或无菌小克氏瓶中，令其凝固，贴壁。

2．置冰箱内24—48小时，待血块收缩后，用无菌吸管吸出上层澄清血清。

3．用无菌玻璃棒将血块与容器壁分开，又可释出一部分血清，但这部分血清可能含有血球，需离心沉淀除去血球。以吸管吸取上层血清。

4．取出的血清可测定效价加以注明供使用时参考，于灭菌后加入0.5%石灰酸或0.01%硫化汞等防腐剂，保存于冰箱中备用。